天然产物提取与分离课件

1、第二章 提取分离一般方法提取分离前准备工作（1）查阅文献，了解植物的学名 、产地、药用部位、采集时间、采集方法等。（2）查阅文献，了解待分离组分的物理化学性质、 性能、应用前景、现有分离状况。_已知成分可直接按参考文献进行。(3)药物活性测试： 对于从天然药物中寻找未知的有效成分时，提取分离过程中还要选好活性测试体系（酶、细胞）及药物筛选方法，包括：动物模型实验、临床验证等。第一节、提取方法（extraction)常见提取方法水蒸气蒸馏法升华法超临界流体萃取方法溶剂法 几个方法是相互关联的，有时同时使用。但溶剂法经典、常用。（一）水蒸气蒸馏方法（hydro distillation)将原料粗粉

2、或碎片浸泡润湿后，加热蒸馏（水上蒸馏）或通过水蒸气蒸馏，也可在多功能提取器中边煎煮边蒸馏，原料中的挥发性成分随水蒸气蒸馏而带出，经冷凝后分层收集。该法适用于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，难溶或不溶于水的化学成分的提取。 例如：挥发油的提取，小分子生物碱麻黄碱、烟碱、槟榔碱等的提取。此类成分的沸点多在100 oC以上，且在约100 oC时存在一定蒸汽压。当物料与水一起加热时，所提取成分蒸汽压和水的蒸汽压总和为一个大气压时，液体开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一同带出。水蒸气蒸馏的原理（二）升华法利用天然产物中待提取成分易于升华的性质进行提取的方法。如茶叶中提取咖啡因，将茶叶的索氏萃取液，在沙

3、浴中加热，萃取液中的白烟状物质，冷凝后形成的白色晶体即为咖啡因。该法应用范围很有限。常见如水杨酸、苯甲酸、樟脑等具有升华性质。（三）超临界流体(super critical fluid, SCF)萃取 指超过物质本身的临界温度和临界压力状态时的状态。1超临界流体超临界流体一方面有和液体相近的密度和溶解度，另一方面具有气体的优点，黏度小，扩散系数大，对物料的渗透性好，有良好的传热传质特性。 以某一个气体介质为萃取剂，在其超临界流体状态下，从液体或固体物料中萃取出待分离组分的一种方法。2超临界流体萃取3超临界流体萃取原理超临界流体对萃取成分的溶解度与萃取压力及萃取温度有关。超临界萃取可通过改变温度

4、和压力进行。压力升高，流体密度增加，溶质在超临界流体中的溶解度急剧增加。压力下降，溶解度降低，从而将溶质从超临界流体中分离出来。温度升高，流体密度降低；温度降低，流体密度升高；但温度变化时分子的扩散性也变化，温度变化时，溶质溶解度是升高还是降低由流体密度和扩散性二者的综合作用决定。了解4超临界CO2流体萃取特点CO2的临界温度31.1C，临界压力7.32MPa。萃取条件温和，适于具有热敏性或易于氧化成分，萃取介质可循环使用。超临界CO2 萃取效率高，绿色环保。CO2化学性质稳定，无腐蚀，无毒性，不易燃，不易爆，萃取后容易从分离成分中脱除，不会造成污染，适于食品及医药行业。工艺条件容易控制，通过

5、调节温度、压力，可实现选择性萃取分离。需要冷媒和高压支持，且生产量较小，操作成本大。5超临界流体萃取应用中草药有效成分萃取：例银杏叶中萃取银杏黄酮及银杏内酯,茶叶中萃取茶多酚。香精香料、色素的萃取：例如柠檬果皮中萃取橙花醇，迷迭香中萃取迷迭香油。动植物油脂的萃取：例如小麦胚油（富含维生素E)萃取，从鱼油中高度不饱和脂肪酸EPA(25碳-5-烯酸）和DHA（22碳-6-烯酸）的萃取（ 降血脂、防血栓、保护血管、增强血液流动功能）。（四）溶剂提取(溶剂浸提）将溶剂加入物料中，使其所含的一种或多种组分溶出，称溶剂提取。是常见的应用范围最广的提取方法。液体溶剂提取固体物料称为固液萃取。液体溶剂提取液体

6、物料称为液液萃取。影响溶剂提取效果的因素主要取决于选择合适的溶剂和提取方法。1提取方法提取方式：煎煮、浸提、渗漉、索氏提取等。提取工艺参数：原料的粉碎度、提取温度、浓度差、提取时间、操作压力、原料与溶剂的相对运动（如搅拌）等。2溶剂的选择原则待提取成分在溶剂中的溶解度应尽量大; 杂质成分在溶剂中的溶解度尽量小;溶剂不能与提取的物质起化学反应，安全无毒，萃取后易于除去。溶质在溶剂中的溶解符合“相似相溶”规律，待提取成分与溶剂分子的极性越相似，其溶解度越大。分子极性概念极性是一种抽象概念，用以表示分子中电荷不对称（assymmetry)的程度，大体上与偶极矩(dipole moment)、极化度(

7、polarizability)及介电常数(dielectric constant)等概念相对应。 _（课本pp25-27) 分子的极性与分子结构及分子大小有关；分子结构指分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素。分子大小指分子碳链长度、骨架大小，与分子量相关。影响分子极性的因素例如，甲醇、乙醇的分子较小，有羟基基团，与水的结构相近，是亲水性较强的溶剂，能与水互溶。例如，丁醇、戊醇分子虽有羟基基团，但因分子碳链加长，分子中非极性部分份额增大，虽然与水互溶，但达到饱和状态后会分层。一般分子中官能团的极性越大或极性官能团的数量越多，整个分子的极性就越大，亲水性就越强；分子中非极性部分越大或碳

8、链越长，分子的极性就越小，分子的亲脂性就越强。官能团的极性顺序大小极性分子的极性大小比较极性顺序：苷A苷B次苷D次苷C次苷A次苷B单乙酰次苷B 常见溶剂极性大小顺序水甲醇乙醇正丙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯氯仿无水乙醚苯四氯化碳环己烷石油醚思考：如何解释溶剂的极性顺序？中草药提取如何选择溶剂？选择的溶剂应对目标组分溶解度大，对杂质成分的溶解度小，不能与提取的物质起化学反应，安全无毒。提取分离已知成分，根据结构判断极性，按照“相似相溶”原则选择溶剂。未知成分，根据一般性经验选择溶剂。 _极性小的亲脂性化合物如萜类、甾体等脂环化合物、芳香类化合物氯仿、乙醚溶剂。 _糖苷、氨基酸等极性大的成分水或含水的醇溶

9、液。 _酸性、碱性及两性化合物与不同pH值时，存在形式（解离或游离）有关中草药溶剂提取一般程序（一）1多种溶剂，以其极性由小到大递增的方式提取 石油醚、汽油溶剂：极性小的亲脂性化合物 氯仿、乙酸乙酯溶剂：游离生物碱、有机酸、黄酮、香豆素的苷元等中等极性成分丙酮、甲醇或乙醇：皂甙类、生物碱盐、鞣质等极性化合物水：氨基酸、糖类及无机盐等水溶性成分萃取液除去溶剂后，得到萃取物（浓缩液或浸膏）（一般旋转蒸发方法）得到的各个萃取物再进一步分离精制，若提取有效成分还需测定活性部位后，再进一步分离精制。丙酮、甲醇或乙醇 水 植物（干燥、粉碎）石油醚、汽油 极性小的亲脂性化合物 剩余部分氯仿、乙酸乙酯 游离生

10、物碱、有机酸、黄酮、香豆素的苷元等中等极性成分 剩余部分苷类、生物碱盐、鞣质等极性化合物 剩余部分氨基酸、糖类及无机盐等水溶性成分 溶剂极性递增方式提取中草药溶剂提取一般程序（二）2直接用极性大的溶剂提取,再按照溶剂极性递增的方式进一步分离.乙醇、含水乙醇或含水丙酮提取，浓缩成膏制成硅藻土粉.以极性递增的方式提取硅藻土粉,得到各个提取液或提取膏,再进一步分离精制.过滤极性递增方式分离 先极性溶剂提取， 再溶剂递增分离植物（干燥、粉碎）极性大的乙醇、含水乙醇或含水丙酮提取 残渣提取液浓缩成膏硅藻土粉 减压干燥成粉分离精制或测活性分离精制或测活性影响溶剂提取效果的因素选择合适的溶剂；提取方式：煎煮

11、、浸提、渗漉、索氏提取等；提取工艺参数：原料的粉碎度、提取温度、浓度差、提取时间、操作压力、原料与溶剂的相对运动（如搅拌）等。提取方式溶剂浸提方式：煎煮法、浸渍法、索氏提取法、渗漉法影响提取效果的因素：原料粉碎度、浸出温度、浓度差（溶剂量）、浸提时间、溶剂种类1煎煮法将原料加水煎煮取汁的方法。一般用于提取能溶于水、对于加热、水解均稳定且不易挥发的组分，所用溶剂为水（水提液）。如何煎煮法提取？将原料适当地切碎或粉碎，置适宜的煎煮器中；加入适量水浸没原料，充分浸泡后加热至沸，保持微沸浸出一定时间；分离并收集各次的煎出液，离心分离或沉淀除去所含固体颗粒物料，浓缩除去溶剂，即可。煎煮法的缺点煎煮液中杂

12、质较多，含淀粉、黏液质等成分的原料，煎煮后溶液黏度大，不易过滤，且易霉变腐败。一些不耐热，易于挥发，易于水解的成分在煎煮过程中易被破坏损失。2浸渍法将原料用适当的溶剂在常温或温热的条件下浸泡出有效成分的一种方法。包括冷浸和热浸。冷浸，适于提取遇热易于被破坏的物质，及含淀粉、树胶、果胶、粘液质的物料。热浸，由于提取温度高，各组分溶解度增大，提取效率高。但不适于热敏性物质。如何浸渍提取？取适量粉碎后的原料，至于有盖容器中，加入适量的溶剂密盖；搅拌或振荡，浸渍至适当时间使有效成分浸出；倾取上清液、过滤、压榨残渣、合并滤液或压榨液，浓缩除去溶剂。浸渍法的应用范围及优缺点适于粘性的、无组织结构的、新鲜及

13、易于膨胀的原料的浸取（溶剂需深入物料中）；尤其适于有效成分遇热易于挥发或易于破坏的原料的浸取。（条件温和）；操作时间长，溶剂用量大，浸出效率差，不易完全浸出，不适于有效成分含量低的原料。水作为溶剂时，夏季易于发霉变质。3渗漉法将原料粉末湿润膨胀后装于渗漉器内，溶剂从渗漉器上部添加，渗过原料层往下流动过程中溶剂将成分浸出，不断加入溶剂，可以连续收集浸提液的方法。渗漉法的应用范围及优缺点由于原料不断与新溶剂或含有低浓度提取物的溶剂接触，始终保持一定的浓度差，提取效果比浸渍法高，提取完全。溶剂用量大，对原料的粒度及工艺要求较高，并且可能造成堵塞而影响正常操作。4索氏提取法将原料用索氏萃取装置进行提取

14、的方法。溶剂在回流温度下萃取物料成分，温度高，溶解度大。但不适于热敏感性成分的提取。（未知成分慎用）每次萃取物料的溶剂均为反复回流的新鲜溶剂，萃取效率高，溶剂用量小。 索氏提取器（脂肪提取器）简易装置图1原料的粉碎原料粉碎后粒度变小，接触面积大，表面能增加，进出速度加快。但粉碎度过高，样品粉粒表面积过大，吸附作用增强，反而影响扩散速度，不利于浸出。提取工艺参数原料的粉碎度提取温度浓度差提取时间操作压力原料与溶剂的相对运动（如搅拌）等许多不溶性高分子物质颗粒进入浸出液中，给过滤造成困难，样品过细在渗滤过程中易于堵塞，渗漉法浸提时，原料粒度过细造成溶剂流经原料层的空隙过小，造成溶剂流动的阻力大，影

15、响传质。1原料的粉碎度一般而言，粒度以20-60目较好。2浸出温度温度升高，各组分溶解度增大，扩散系数增大，有利于浸提；温度升高可使原料中的蛋白质凝固、酶破坏、增加浸提液的稳定性。（优点）浸提温度过高，热不稳定成分被破坏，浸提液品质劣变，提取的杂质含量增高，给后续精制带来困难； （缺点）一般浸出温度控制在60-100C。3浓度差浓度差指原料组织内的浓度与外周溶液的浓度差异。浓度差越大，扩散推动力越大，越有利于提高浸出效率。（溶剂量大）当所浸提组分在物料内外的浓度达到平衡时，扩散停止，成分不再浸出。在浸出过程中，不断搅拌或更换新溶剂或采取流动溶剂的渗漉法，可增大扩散层中浸提成分的浓度，提高浸提效

16、果。4浸提时间浸提时间延长，提取效率增加，但时间过长，杂质成分的溶解也随之增加，给后序分离精制造成困难。一般热提1-3小时，乙醇加热回流提取1-2小时。5其它对于组织坚实，浸出溶剂较难浸润时，可增大一些压力，增大压力虽然对于扩散速度没影响，但可使某些组织内细胞壁破坏，有利于有效成分的溶解。如超声萃取等采取破坏植物细胞壁的方法。第二节、提取物精制分离的一般方法按分离精制基本原理分为一、根据溶解度差别进行分离二、根据沸点不同进行分离三、根据液-液分配系数不同分离四、根据化合物吸附能力差别分离五、根据分子大小分离六、根据物质解离程度分离一 、根据溶解度差别进行分离1. 利用温度不同引起溶解度改变,使

17、结晶及重结晶；2. 加入另外一种溶剂以改变原有溶剂的极性、使一部分物质沉淀析出；调节pH值，改变酸、碱或两性物质的存在状态，以改变溶解度，达到分离目的；加入沉淀剂使酸性或碱性化合物转化成水不溶性的盐类析出。1. 利用温度不同引起溶解度改变,使结晶及重结晶。结晶法结晶法是分离精制固体成分的重要方法，是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同来达到分离的方法。结晶需要适宜的条件(温度、溶剂、浓度）。结晶为同类分子自相排列，如果杂质过多，阻碍分子排列。结晶法更适于样品纯化精制。一般所用样品必须是已经用其它方法提得比较纯的时候才能采用此法精制，天然产物粗提取物的纯度很差，很难得到结晶。分步结晶法有些样品

18、中含有两种以上的成分时，可用分步结晶法使之分离。分步结晶法是将粗品溶于适宜的溶剂中，经处理使先析出的结晶1滤出，分出结晶后的母液浓缩后再析出结晶2，母液再浓缩析出结晶3.分步结晶法得到的各个晶体纯度差别较大,在未加分析检测前,不要将其贸然混合。化合物结晶纯度判断:根据化合物晶形、色泽、熔点、熔程、薄层色谱或纸色谱等。2. 加入另外一种溶剂以改变原有（混合）溶剂的极性、使一部分物质沉淀析出。水/醇法：中草药浓缩水提液中，加入大量的高浓度乙醇则多糖、蛋白质等水溶性杂质被除去。醇/水法：浓缩乙醇提取液中加入大量的水除去叶绿素、树脂等水不溶性杂质成分。醇/醚（酮）法：浓缩乙醇提取液中加入大量的乙醚（醇

19、/醚法）或丙酮（醇/酮）法，以除去皂苷杂质，但脂溶性树脂仍存在于母液中。树脂：存在于植物组织的树脂道中，当植物受伤后分泌出来，露于空气中干燥形成的一种无定形的固体或半固体物质。树脂与树胶不同，不是多糖类化合物，而是一类化学组成较复杂的混合物。树脂性脆，不溶于水，能溶于乙醇、乙醚、二硫化碳、氯仿等有机溶剂。树脂受热时，先软化而后变为液体，具有粘性，燃烧时发生浓烟及明亮的火焰。叶绿素：不溶于水难溶于冷甲醇，可溶于石油醚，易溶于乙醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等有机溶剂。粘液质：与树胶结构相似的多糖类物质，多存在于植物薄壁组织的粘液细胞内，是植物细胞的正常代谢产物。如：琼脂、果胶、海藻酸钠等。树胶：植物体

20、的裂口或破伤处分泌出的一种具有保护性的稠厚液体，在空气中逐渐干燥，形成无定形、质脆、透明的固体，遇水能膨胀或胶溶成粘稠状的胶体溶液，在乙醇或多数有机溶剂中不溶解。树胶分子中含有至少两种单糖。如：阿拉伯树胶是一种有分支结构的多糖，既有糖的主链又有支链。3. 调节pH值，改变酸、碱或两性物质的存在状态，以改变溶解度，达到分离目的。酸/碱法：生物碱在酸性水溶液条件下提取出来，加入碱调节至碱性则可从水溶液中沉淀析出。碱/酸法：酸性成分(黄酮、蒽醌等)在碱性水溶液条件提取出来，加入酸调节至酸性可从水中沉淀析出。4、加入沉淀剂使酸性或碱性化合物转化成水不溶性的盐类析出的方法，再通过复分解反应回收。包括钙盐

21、、钡盐、铅盐等。 例如：有机酸性化合物转化成铅盐沉淀析出，再通入硫化氢气体将其还原，可得到有机酸类化合物。提取液中加入铅盐析出沉淀；将铅盐沉淀从提取液中滤出；将沉淀再悬浮于水或稀醇中；通硫化氢气体或加硫酸钠等试剂；提取物解离脱铅；回收提取物。铅盐沉淀法铅盐沉淀法铅盐法是利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅，在水或稀醇溶液中，能与许多物质通过酸碱中和或络合生成难溶的铅盐沉淀的分离方法。可用于沉淀杂质，也可用于沉淀有效成分。中性醋酸铅：可沉淀有机酸、蛋白质、氨基酸、粘液质（与树胶结构相似的多糖类物质）、鞣质、酸性皂甙、树脂、部分黄酮苷和花色苷等。Pb(Ac)2碱式醋酸铅：可沉淀中性醋酸铅沉淀的所有物质；还可

22、沉淀中性皂苷、异黄酮苷、糖类和一些碱性较弱的生物碱。Pb(OH)Ac5盐析法 在水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中溶解度降低，从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵。 例如麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时往往先将水提液中加入一定量的食盐，使在水提液中溶解度降低，再用有机溶剂提取。二、根据沸点不同进行分离分馏法对于能够完全互溶的液体系统，理论上均可采用分馏法。中草药研究中，挥发油及一些液体生物碱的分离常采用分馏法。例如毒芹总碱中的毒芹碱(沸点166-167C ）和羟毒芹碱（沸点226C)，通过分馏法分离。一般液体混合物沸点相

23、差在100C以上，可将溶液重复蒸馏多次达到分离目的，在25C以下，需采用分馏柱，沸点相差越小，需要的分馏装置越精细。分馏装置 流向冷凝管之前的最后部分，是测定（即时）馏分温度（沸点）的最佳位置。当热源温度合适时（蒸馏速度每秒12滴），馏出物蒸气能充分浸润温度计水银球，所得温度计示数为此时馏出物的沸点。 三、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离（液-液萃取）简单液-液萃取逆流分溶法（CCD）液滴逆流色谱法（DCCC）高速逆流色谱法（HSCCC）气-液分配色谱法（GC,GLC）液-液分配色谱（LC,LLC）液-液萃取基本原理 1分配系数K（分配比） 两种相互不能任意混溶的溶剂(如氯仿与水），如

24、果在分液漏斗中充分振摇，放置后将分成两相。 在一定温度及压力下，当体系达到平衡时，一种溶质在相互不能任意混溶的两种溶剂中的分配比为一常数，此常数称分配系数K， K=CU/CL CU:溶质在上相溶剂中的浓度，CL：溶质在下相溶剂中的浓度（可为百分比浓度，可为摩尔浓度） 例如：假定A,B两种溶质用氯仿/水进行分配，如A,B均为1.0克，KA=10, KB=0.1,两相溶剂体积比V氯仿/V水=1,用分液漏斗一次振摇后，上相溶剂水中A占90%以上，下相溶剂氯仿中A小于10%； 同理,溶质B的分配将与A相反，留在水中的小于10%，留在氯仿中的占90%以上。 说明， A, B两种溶质在氯仿/水中，仅作一次

25、振摇即可实现90%以上的分离。 计算 =KA/KB=100分离因子：A,B两种溶质在同一溶剂系统中（如氯仿/水）中分配系数的比值 =KA/KB (KAKB)越大分离越容易，实际操作时，应选择值大的溶剂系统。2分离难易与分离因子分离难易与分离因子 一般 100时，萃取一次可达到90%分离，认为已实现了基本分离。 100 10，则需要萃取10-12次； 2时，需萃取100次以上才能完成分离； 1，KA=KB，两个化合物性质相近，作任意次分配也无法分离。根据分离因子选择液-液萃取方案 50，简单萃取可解决, 50，需用逆流分溶法。对于未知组分组成的混合物，不知道混合物中各个组分在同一个溶剂系统中的分配比，如何求得值？借助纸层色谱（PC, paper chromatography)PC的分离原理与液-液萃取方法相同。Rf：相对比移值，溶质组分在纸上爬行的距离与溶剂前沿距离的比值。纸色谱两种展开方式r, 纸层色谱定数。当层析滤纸的湿重为干重的1.5倍时, r=2.设A、B 两种(或两组物质的)Rf 值 分别为 Rfa Rfb，分离因子根据PC计算得到值，即可设计液-液萃取分离物质的最佳方案3分配系数与pH值对于酸性、碱性及两性有机化合物，因pH值将影响到其存在状态（解离或游离），分配比除了与温度、压力有关外，还受溶剂系统的pH