植物育种学课件-生物技术育种

1、第九章 生物技术育种什么是生物技术？生物技术（Biotechnology ）：Bio Biology Technology ApplicationThe application of Biologyfor the benefit of humansWhat is Biotechnology ?Traditional/old biotechnologyThe conventional techniques that have been used to produce beer, wine, cheese, many other food. Beer, Bread, and Wine Making

2、 are Centuries Old. Ancient Egyptian drawing of a cylinder seal impression on a jar stopper bearing the name of Khasekhemwy, a Dynasty 2 pharoah. It shows a grapevine trained to run along a trellis or arbor. (around 2700 b.c.) 远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料人类最早发明的酒微生物发酵我国古代的酿酒作坊（四川新都县出土的汉代画像）New/modern b

3、iotechnologyAll methods of genetic modification by recombinant DNA and cell fusion techniques, together with the modern development of traditional biotechnological process.组织培养Micropropagation白菜甘蓝白菜甘蓝体细胞杂交基因工程重组乙肝疫苗基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞

4、食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取420mg干扰素，若从人血中提取干扰素，300L血才提取1mg！人造血液及其生产 Science Vol. 222, Nov. 1983Time Magazine, March 19971983 SCIENCE Cover Transgenic Mice1997 TIME Cover - Dolly“黄金”大米通过转基因技术，转化胡萝卜素合成酶基因，使大米富含胡萝卜素，从而解决人们缺乏维生素A的问题，而大米也成了金黄色的“黄金大米”。转基因技术转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因

5、的番茄转GFP 基因的烟草和小鼠Control tomatoes at 200 mM NaClTransformed tomatoes at 200 mM NaClInsect ResistanceTransgene=Bt-toxin proteinCold ToleranceTransgene=CBF transcription factors对照和转Bt基因的棉花对照和转CBF的拟南芥S sensitive plantsR resistant plants PCR-RFLP marker linked to nematode resistance gene Mi分子标记辅助育种Biotec

6、hnology: A collection of technologiesThe Applications of BiotechnologyMedical BiotechnologyDiagnosticsTherapeuticsVaccinesAgricultural BiotechnologyPlant agricultureAnimal agricultureFood processingEnvironmental BiotechnologyCleaning through bioremediationPreventing environmental problemsMonitoring

7、the environment本章主要内容第一节 细胞工程育种第二节 基因工程育种第三节 分子标记技术及园艺植物育种第一节 细胞工程育种 植物细胞工程 指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育植物个体或获得某种有用物质的过程。（主要包括园艺植物离体培养以及以此为基础的细胞融合技术、细胞器移植技术、染色体工程、倍性育种等。）一、植物离体培养二、组织和器官培养三、原生质体培养和体细胞杂交四、染色体工程这部分在组织培养课上已经讲过，这里不详述一、园艺植物离体培养 植物离体培养（in vitro cult

8、ure）即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁后的原生质体）等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。 切取接种愈伤组织的形成分化形成小芽或根试管苗的形成移栽植物离体培养主要包括：1、胚胎培养（embryo culture）2、器官培养（organ culture）3、组织或愈伤组织培养（tissue or callus culture ）4、细胞培养（cell culture）5、原生质体培养（protoplast cultur

9、e）离体培养技术在园艺作物育种上的应用 1、种质创新克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 远缘杂交的障碍：杂交不亲和性（cross-imcompatibility） 试管授粉受精杂种不育性（hybrid invability） 幼胚培养和胚胎拯救、体细胞融合杂种不稔性（hybrid infertility） 获得体细胞杂种（ somatic hybrid ） 体细胞杂交可以获得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种，转移胞质遗传性状（如雄性不育性）以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移。A somatic hybrid (center) between cultivated potato (

10、left) and wild species (right).突变诱发与体细胞无性系筛选 体细胞无性系变异（somaclonal variation）是选择变异的一个重要来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或环境逐个进行筛选。通过这一途径，已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条件细胞系，从而成功进行离体选择 Example of somaclonal variation; a dwarf banana after micropropagation Carrot family lines regenerated from tissue-cult

11、ure. Both have been grown for 12 weeks in a glasshouse after 10 weeks vernalisation. Family 16 (LHS) are flowering abundantly, while Family 17 (RHS) have not flowered. 遗传转化受体系统 进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体、叶片或愈伤组织等外植体作为受体进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力 倍性育种（胚乳培养、花药培养）利用花药及花粉培养进行单倍体育种，将优良的单倍体进行染色体加倍，便

12、可迅速地获得纯合的二倍体，从而加速亲本材料的纯化。三倍体植物也可通过胚乳培养再生植株的途径获得。2、无病毒苗木繁育 对于无性繁殖作物感染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养或再结合如热处理等其它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。 如马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等脱毒3、种质资源保存中国农业科学院国家种质资源库 利用茎尖培养结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资源，特别是对一些无性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它不仅节约空间，又可减少病虫为害，也便于运输利种质资源的交换。 4、生产人工种子种皮胚芽胚根现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功。胚乳

13、或子叶二、组织和器官培养略三、原生质体培养和体细胞杂交 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 植物原生质体培养是指将植物细胞去壁后，放在无菌条件下，使其进一步生长发育的技术。植物原生质体培养研究中的重要成就： 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第

14、一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。1、原生质体培养的意义：Washing process to remove debris PROTOPLAST ISOLATION AND PURIFICATION2、原生质体的分离 植物细胞具有细胞壁，获得大量有活力的原生质体，需要设法去掉细胞壁。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞，在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液

15、），运用分离细胞和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。影响原生质体分离的因素：（1）材料来源：叶肉细胞是常用的材料， 其次为愈伤组织或细胞悬浮培养物。此外 , 从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生质体。（2）渗透压原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压。CPW溶液甘露醇或蔗糖调节，维持较高的渗透压。（3）酶 植物细胞壁结构复杂 , 由纤维素和半纤维素组成 , 需要一定的酶组成才能降解它。（4）分离培养基。 钙离子、镁离子和PO43- 等对原生质体的活力保持很重要，（5）培养条件酶处理时的温度和 pH 最重要。 PH 缓冲剂

16、MES，PH范围4.8-7.2（6）组织前处理 高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果。3、原生质体培养 原生质体培养前必须调到一定密度，一般 103105/ml 的密度比较适合原生质体培养。原生质体的培养方法各种各样，依作物和材料来源而异。平板培养液体浅层培养悬滴培养液、固双层培养琼脂糖包埋看护培养等影响原生质体培养的因素培养基：基本培养基、生长调节剂、有机附加物等物理条件：密度、光照和温度等都会影响培养效果。 低于一定密度原生质体不能分裂，一般认为大群体的原生质体有利于将培养基中原生质体在培养过程中释放的有害物质脱毒。原生质体培养一般在

17、暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有的物种一直在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后移到光下。照光与否以及什么时候照光，光强如何，均直接影响着植板率。植板率的计算公式如下： 植板率=形成小愈伤块个数/接种时细胞总数100% 4、体细胞杂交（somatic hybridization），也称原生质体融合（protoplast fusion），是在离体条件下将同一物种或不同物种的原生质体进行融合培养并获得杂种细胞的再生植株。 体细胞杂交的意义：克服了植物种属间生殖障碍，为新种质的创造提供了一条有效途径。用于转移母性遗传性状，如分别由叶绿体和线粒体基因控制的不同的除草剂阿特拉津抗性和雄性不育性状等。利用

18、非对称融合技术，将采用X-射线处理抑制核活性的雄性不育系（供体），与用碘乙酰胺处理抑制胞质活性的受体进行原生质体融合，获得具有雄性不育性状的二倍体胞质杂种，而且雄性不育性状可稳定地遗传。 植物体细胞杂交的过程植物细胞A植物细胞B原生质体A原生质体B原生质体融合正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞愈伤组织杂种植株去掉细胞壁植物组织培养植物细胞融合原生质体的融合方式 自发融合（spontaneous fusion） 当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原生质体融合在一起形成同核体（homokaryons），即自发融合。这种自发融合的每一个同核体中可以发现有240个核。当利用正处于活跃分裂的培

19、养细胞制备原生质体时，更容易出现这种多核融合体。诱导融合（induced fusion） 化学融合 电融合两种。化学融合 多采用高分子量的（1500 6000MW）2850的聚乙二醇（PEG）处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然后再用高钙、高pH的溶液处理，形成异核体（heterokaryons）。电融合 主要步骤是：原生质体悬浮液在两极间施加高频交流电场（一般为0.41.5MHz，100250V/cm），使原生质体偶极化而沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲（一般为310s，13KV/cm）来引发质膜的可逆性破裂而形成

20、融合体。Potato leaves suspended in wall-dissolving enzyme solutionProtoplasts float to top in sugar solutionPotato leaf protoplasts immediately after digestion of cell walls叶肉细胞经酶解去壁获得原生质体Freshly isolated potato protoplastsTwo protoplasts ready to fuse together Fusion products begin to divide on nutrien

21、t medium small shoots emerge from the green calliPutative somatic hybrid plantsS. bulbocastanumSomatichybridPotatoSomatic hybrids have ALL of the chromosomes from each parent plant四、染色体工程 按照特定目标，通过对染色体操纵，来改变染色体的组成，并进而改变其遗传特性的过程叫染色体工程。通常包括倍性育种（单倍体与多倍体育种）、体细胞杂交、染色体的遗传操作（异附加系、异代换系等）以及染色体微切割、人工染色体等。此处仅就

22、染色体微切割、人工染色体作一介绍。1染色体微切割、微克隆 染色体微切割（microdissection）、微克隆（microcloning）是指在显微镜下利用特种工具，对特定染色体片段进行微切割加工，并从分离相中分离出来，进行DNA体外扩增并克隆到载体中以构建特定染色体区段、特异性DNA文库的技术。 该技术首先在动物及人类遗传中建立，1991年首次应用到植物中。目前已有多种植物，如番茄、柚、银杏、大豆、百合、蚕豆等的染色体显微分离、文库构建与特定序列的克隆。 目标染色体分离克隆的前提是高质量的染色体制片。染色体大小、臂比、随体有无等形态特征是识别染色体的最常用的依据。端着丝粒染色体形态独特，无

23、需分带和荧光染色即可在有丝分裂中期加以辨认，因而是理想的微切割材料，可提高分辨率、准确性，也可通过分带或荧光原位杂交等技术加以鉴别。微克隆方法有两种；一是酶解直接克隆法，目标染色体片段经蛋白酶裂解后提取出目标片段DNA，由于目标染色体DNA的量很少，最初的染色体微切割需切割分离大量染色体（100200条）；另一是PCR介导克隆法，PCR技术的应用大大促进了染色体微切割、微克隆技术的发展。单条染色体经内切酶消化后，在DNA片段两端加接头，接头内可包含根据克隆需要而设计的内切酶位点，并根据接头序列设计引物进行PCR扩增。扩增产物可进行微克隆、构建成染色体或染色体片段DNA文库。目前染色体微切割仍局

24、限于构建特定染色体和特定染色体片段的DNA文库。这种文库可用来筛选目标基因的候选克隆，也可以从中筛选对某个染色体区段有特异性的探针，这些探针属于同一连锁群，因而可用来构建高密度分子标记连锁图，进行YAC、BAC文库筛选。2人工染色体 真核生物染色体呈线状，着丝粒、端粒和复制起始点是真核生物染色体的最基本的组成元件。1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。 酵母

25、人工染色体（Yeast artificial chromosome ，YAC）YAC载体的基本组成部分：* 一段来自酵母染色体的着丝粒序列（CEN）；* 一段控制酵母DNA复制的自主复制序列(autonomously replicating sequence, ARS)* 一对酵母的端粒序列，有的载体中（如pYAC4）来自四膜虫染色体；* 选择记号；* 克隆位点 第一个酵母人工染色体Murray和Szostak（1983）在大肠杆菌质粒pBR322基础上加入酵母着丝粒，ARS及四膜虫的核糖体RNA基因末端（Tr，其结构和功能与端粒DNA相似）及基因，总长度为10.7kb。 YAC是基因工程的主

26、要载体和基因组分析的有力工具。现已构建了人、牛、猪、绵羊、小鼠、果蝇等动物以及拟南芥、玉米、番茄、大麦、甜菜、水稻和马铃薯等植物YAC文库。 细菌人工染色体（BAC） 细菌人工染色体是以大肠杆菌F因子为基础构建的，具有F因子遗传稳定的优点，可负载小于350kb的DNA片段。BAC的环状形式存在于E.coli中，在宿主菌中能稳定遗传，没有缺失，重组和嵌合现象，转化效率高，极大方便了目的基因筛选。目前已构建了人、牛、鼠、鸡、水稻、高粱等生物的BAC基因组文库。优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克

27、隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。细菌人工染色体（BAC） 本节课结束，下节课讲“基因工程育种”，请同学们事先预习，找些相关的资料看看。第二节 基因工程育种 基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物，是现代生物技术的核心。它能按人类需要，把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装，合成新的DNA分子，再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。 植

28、物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、基因遗传转化技术及植物组织培养技术的发展而兴起的生物技术。 可定向改造遗传性状； 打破物种间生殖隔离障碍； 在园艺植物重要园艺性状的遗传改良、抗逆抗病育种、品质改良与种质创新等方面发挥着日益巨大的作用。我们常听到的几个名词：转基因食品抗虫棉GMO转基因食品(Genetically modified foods，GMF，又称基因修饰食品或基因改良食品)，系指利用基因工程技术改变基因组构成的动物、植物和微生物生产的食品和食品添加剂。抗虫棉指转Bt基因的棉花，我国的转基因抗虫棉研究起步于1990年，1996年大面积试种，1999年进入推广阶段。此后，种植面积

29、逐年扩大。2002年，国产抗虫棉在全国累计推广面积达到3000万亩，2003年已接近5000万亩。GMO是genetically modified organisms 的缩写，指通过基因工程改造的生物。The Biotech Revolution1996199719981999200020012002Brandt, 2003Crops available that have been genetically modifiedCornSoybeansCottonCanolaCauliflowerTomatoSugarbeetPapayaPotatoCabbageNot available for

30、 commercial productionWheatBarleyGrapesBananasPineappleCarrotsAlfalfaTobaccoSugarcaneRicePeppersOnionCelery2001年转基因植物种植面积比例大豆63%油菜 5%棉花 13%玉米 19%The U.S. Leading the Way in GM CropsThe U.S. Leading the Way in GM CropsTransgenic plants were first created in the early 1980s by three groups working ind

31、ependently. Subsequent research has developed transgenic plants with commercially useful traits such as resistance to herbicides, insects, and viruses.83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02FirsttransgenicplantDelay-ripening tomatoCommercialized in the USFirstfieldtests6/92Herbic

32、ide resistant, insect resistant plants commercializedGM maize approved by EU First Bt corn plants 6/90Rotting resistant tomato approved by FDA转基因植物发展简史Increase tolerance to adverse growing conditions, e.g. cold/heat/droughtIncrease crop yields, e.g. increase the size and number of seed Provide resis

33、tance to pests and reduce the use of pesticidesImprove sensory attributes of food, e.g. flavor, textureSelectively reduce allergy-causing properties of some foods Increase the nutritional value of crops, e.g. increase the protein content of rice转基因技术在育种上的应用：1995年转基因作物的全球销售额为7500万美元， 2000年近30亿美元，2005

34、年将近达到80亿美元。The United Nations estimated that with the world population reaching 7.15 billion by 2015, 575 million people will face chronic malnutrition and famine. By increasing crop production and nutrient composition, GM food has the potential to reduce hunger, malnutrition, and perhaps alleviates

35、 poverty一、植物基因工程的主要步骤步骤主要包括：（一）目的基因的获取（二）植物表达载体的构建（三）遗传转化四、转化细胞筛选及转基因植株鉴定五、外源基因整合及表达分析六、转基因作物新品种选育（一）目的基因的获取1、目的基因的来源Exogenous genes (non-plant genes)Applications - transgenicpathogen-derived genesbacterial genesany other organismPathogen resistanceHerbicide resistancebioreactorsDelivery systemsEndo

36、genous genes (Plant genes)Gene discovery (functional genomics)Applications- markers- transgenicEnzymes in biochemical pathwayNatural resistance genesMarker assisted breedingPlant improvementMappingESTs, librariesSilencing, expressionMutants, arrays（1）化学合成（2）筛选基因组文库或cDNA文库（3）PCR方法（ Polymerase Chain R

37、eaction ）（4）图位克隆（map-based cloning）与染色体步移 （chromosome Walking）（5） 酵母双杂交体系Two-hybrid system2、目的基因的获得（1）化学法直接合成基因针对已经知道序列和分子结构的基因，在实验室进行人工合成。 1977年，K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因 基因人胰岛素转运RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791

38、981198219821984 基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶大小（bp）105777170385324375合成年代198519851985198519861987（2）通过筛选基因组文库和cDNA文库克隆目的基因基因组DNA文库（genomic DNA library） 指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片断，克隆到某种载体上而形成的集合。基因组DNADNA片断连接克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶酶切受体菌cDNA文库(complementary DNA library ，cDNA) 指生物某一发育时期或某一特定组织所转录的mRN

39、A经反转录形成的cDNA片断与某种载体连接而形成的克隆的集合。从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。如菌斑杂交法(plaque hybridization)筛选噬菌体核基因库。（3 ）通过聚合酶链式反应（PCR）方法克隆 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物 。PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）

40、一段目的基因的技术。加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。 聚合酶链式反应（PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 聚合酶链式反应（PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段基于PCR方法克隆目的基因的方法如：mRNA差

41、别显示技术（DD-PCR）RT-PCRRACE分离cDNA全长TAIL-PCR代表性差异分析（cDNA RDA）抑制消减杂交法（SSH）(4)图位克隆和染色体步移方法分离目的基因 染色体步移(chromosome walking) 是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA 的彼此重复的序列,而慢慢的靠近目的基因开始步移的克隆可以是已知的基因、RFL Ps、RAPDs 或其它已鉴定的分子标记,用它来杂交筛选大片段DNA 文库中的阳性克隆,这样就得到了“一步”克隆,进一步的走步工作需要新的杂交探针, 利用新获得的探针对文库进行第二次杂交,得到了与探针具重复序列的阳性克隆,称为“二步”克隆,理论上讲,这

42、就向前步查了两步。远距离的目的基因通过这样周而复始的查步而获得。（5）通过酵母双杂交方法克隆目的基因酵母双杂交技术的基本原理（二）植物表达载体的构建 在植物基因转化过程中，已建立了多种转化系统，如载体转化系统，原生质体转化系统，DNA直接导入转化系统，基因枪导入转化系统，花粉管介导转化系统等，但载体转化系统是目前使用最多、技术最成熟、成功实例最多的一种转化系统，也是植物基因工程最重要的一种转化系统，因此所谓植物基因工程载体主要是指这一类载体，它具体包括Ti质粒转化载体、Ri质粒转化载体及病毒转化载体，其中Ti质粒转化载体是最主要的。cause Crown gall diseaseA natur

43、al DNA delivery systemAgrobacterium tumefaciensAgrobacterium is a natural genetic engineeri.e. it transfers some of its DNA to plants A plant pathogen found in nature Infects many plant species Delivers DNA that encodes for plant hormones DNA incorporates into plant chromosome Hormone genes expresse

44、d and galls form at infection siteAuxin, cytokinin, opine synthetic genes transferred to plantPlant makes all 3 compoundsAuxins and cytokines cause gall formationOpines provide unique carbon/nitrogen source only A. tumefaciens can use!天然Ti质粒的主要功能基因：用于天然的Ti质粒必须要进行改造，才能用于基因工程，有几个重要问题必须解决：Ti 质粒太大，很难进行分

45、子生物学操作；在大肠杆菌中要易于操作； 转化植物后，能够易于筛选，不能有致瘤性；单一的限制性内切酶位点，以便外源基因的插入T-DNA中。天然Ti质粒和工程改造Ti质粒的差异包括选择标记基因、报告基因和目的基因一些常见的遗传选择标记和报告基因（Reporter Genes/Selectable Markers）Neomycin Phosphotransferase gene(nptII) 抗卡那霉素Hygromycin(hpt) 抗潮霉素Phosphinothricin(bar) 抗除草剂GUS -glucuronidase enzyme which converts colorless sub

46、strate to blue product 葡萄糖苷酸酶基因Luciferase (firefly) GFP 绿色荧光蛋白基因目前主要采用两种质粒基因转化载体系统，一元载体系统和二元载体系统，目前在植物转化中大多是二元载体系统。Co-integrative一元共整合载体Binary vector二元载体LBRB用于植物转化的工程质粒pCAMBIA1300图谱pB19hpc (Golden Rice Cassette)TLTRaphIV35SGt1psy35SrbcScrtlHygromycinResistancePhytoeneSynthasePhytoeneDesaturaseT-DNAB

47、orderT-DNABorderSelectableMarkerGene ofInterestGene ofInterestInsertionSequenceInsertionSequence用以转化的载体部分结构。（三）植物遗传转化方法1、农杆菌介导的遗传转化2、基因枪介导的遗传转化3、花粉管通道法1、农杆菌介导的植物遗传转化农杆菌介导法植物转基因的原理Agrobacterium-mediated plant transformationAgrobacterium tumefaciens mediated plant transformation农杆菌介导的植物遗传转化必须具备2个前提：1、

48、植物能够被农杆菌侵染 单子叶不易侵染，双子叶植物容易侵染。2、植物比较容易再生regenerable cellsTransformed cellsCells containing new DNA that are able to regenerate into a new plant2、基因枪转化法(biolistics) uses a gene gunDNA is coated onto gold (or tungsten) particles (inert)gold is propelled by helium into plant cells if DNA goes into the n

49、ucleus it can be integrated into the plant chromosomes cells can be regenerated to whole plantsThe Gene GunPDS1000 Microparticle Delivery SystemHelium chamberRupture diskMacrocarrierDNA coated gold particleStopping screenFocusing deviceTarget tissue基因枪转化方法在单子叶植物如玉米、水稻等用的较多。（四）转化细胞的筛选及转基因植株鉴定1、抗性筛选2、

50、报告基因3、核酸杂交4、PCR检测转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析ABCabcabcabcA, 根系； B, 茎杆；C, 叶片。a, Gus 基因由35S启动子驱动； b, Gus 基因由蔗糖合酶基因RSuS1的启动子序列驱动； c, 未转基因水稻植株。A, roots; B, stems; C, leaves. a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively; c, no-transformed plants as negative control.以GFP为报告基因的转基

51、因植株和气孔Southern BlotBegin by cutting DNA of putative transgenic plant into fragments with Restriction Enzymes.Run DNA on an agarose gel“Blot” onto a membraneProbe membraneAutoradiography+ve-veP32 labelled probe2.0kb1.0kb0.5kb 转基因植株中Gus基因的PCR检测PCR analysis of Gus in putative transgenic plantletsM, DNA

52、 marker; P, 以PCAM-Gus1质粒为阳性对照; CK1,以水为模板的阴性对照; CK2,以未转基因植株为阴性对照; 1-6，转基因植株。M, DNA marker; P, PCAM-Gus1 plasmid as positive control; CK1,the templete is water as negtive control; CK2, non-transformed plantlet as negative control; 1-6, putative transgenic plantlets. M P CK1 1 2 3 4 5 6 CK2(563 bp)（五）外

53、源基因的整合及表达分析 通常外源基因在受体植物染色体上是随机插入。也有一些报告表明有时特定的外源基因插入位点在序列上有一定的倾向性，并不完全随机。外源基因插入植物染色体的拷贝数差异较大，插入过程中可能会发生结构变化。 外源基因在转化体中的表达可以通过Western杂交和ELISA分析来检测。Western BlotHighly specific qualitative testCan determine if above or below thresholdTypically used for researchUse denaturing SDSSolubilizes, removes agg

54、regates & adventitious proteins are eliminatedComponents of the gel are then transferred to a solid support or transfer membranePaper towelTransfer membraneWet filter paperPaper towelweight三种印迹技术的比较ELISA 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗

55、体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。wellAntigenBlocking proteinEnzyme-labelled Anti-antibody antibodyGMO protein specific to antigenColour Response Concentration Dependent （六）转基因作物新品种的培育 作物转基因育种可以通过转基因方法直接培育出优良新品种，包括外源目的基因直接导入优良推广品种或品系以改良个别性状，或者是将

56、转基因作物作为亲本材料在作物品种培育过程中间接利用。 植物基因工程育种与常规育种是相辅相成的，基因工程必须与常规育种密切配合，通过杂交或回交育种手段，经大田试验，从而加快优良新品种（系）的培育进程。二、转基因技术在育种上的应用1. New horticultural varietiesUnderstand the anthocyanin (pigment) biosynthetic pathways, can produce novel flower varieties2. Improve pest resistanceTransfer gene that inhibits digestion

57、 of starch (amylase inhibitor) from bean to garden peaStops attack by weevilsTransfer one of many Cry genes from Bacillus thuringiensis to plantsMakes protein (Bt) toxins, only small amount needed in plant to kill insect pestsTransfer viral coat proteins to plants to make them more resistant to vira

58、l attacktobacco mosaic virusPapaya ringspot virusPotato X and Y virusesBollgard cottonNontransgeniccontrolNontransgeniccontrolVirus resistantpotatoNontransgeniccontrolWeevil resistant peasRingspot virusresistant papayaSusceptible plantsEPSP synthase2. Improve pest resistance (contd)Transfer mutated

59、gene in shikimic acid pathway from E. coli to make resistant (Roundup Ready) plantsGlyphosate herbicides inhibit an important enzyme in this pathway; plants need aromatic AAs to grow!3. Improve nutritive value of plantsUse metabolic engineering to insert new pathways into plants or improve expressio

60、n of enzymes in existing ones.Most crop plants are deficient in one or more amino acidsmaize is low in lysine, methionine and tryptophanImprove vitamin quality of crops“Golden rice” higher in beta-carotene, the precursor to vitamin AImprove value of feed cropsTransfer a fungal enzyme (phytase) to cr