生物催化剂修饰和改造

1、关于生物催化剂的修饰与改造第一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 第一节 酶化学修饰及修饰目的 一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；3)具有抗原性。 第二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2. 改变酶特性有两种主要的方法： 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。第三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月3. 酶化学修饰的概念酶的化学修饰（chemical modification）： 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。酶选择性化学修饰

2、： 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。第四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月二、酶化学修饰的目的1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。 过氧化氢酶用右旋糖酐修饰后，在有机溶剂中的溶解性和酶活性也得到提高，如在三氯乙烷中酶活是天然酶的200倍，在水溶液中酶活是天然酶的15-20倍。 第五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2）增强酶的稳定性（热稳定性）。-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，该酶抗不可逆热失活的稳定性在60可提高1000倍。

3、这种稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。木瓜蛋白酶用黄素共价结合修饰后，蛋白酶变成氧化还原酶。第六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 第二节 酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。第七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋

4、白水解酶：1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。第八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。第九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 第三节 酶化学修饰的设计 一、充分认识酶

5、分子的特性 包括酶的 1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性第十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月二、 修饰剂的选择 要考虑 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团） 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件第十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月三、反应条件的选择 要注意 1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间第十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月第四节 酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰

6、 （一）大分子修饰（大分子结合修饰） 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。第十三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2. 修饰剂： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。第十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月3. 应用：如：PEG超氧化物歧化酶（SOD） PEG人血红蛋白 PEG天门冬酰胺酶（ASNase） 降低了抗原性 延长了酶在体内的半衰期又如：用Dextr

7、an修饰-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。第十五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）定义：采用小分子试剂使酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。第十六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。 1. 非极性R基氨基酸（共8种）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A),

8、 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)第十七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,As

9、n,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H)4.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)第十八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应第十九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应试剂特点

10、：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如NH2，-SH等）发生烷基化。可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修饰剂：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 第二十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月烷基化反应第二十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 2) 酰基化反应试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）第二十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月酰基化反应 第二十三张，PPT共四十七页，创作于2022年

11、6月 3) 氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性。氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。还原剂：2巯基乙醇、DTT等。可被还原的侧链基团：二硫键。第二十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。第二十五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 4) 芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂。 碘代： I2 + HI 硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH（四硝基甲烷）第二十六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1) 氨

12、基的化学修饰：来源：Lys, Arg, His, Gln修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂： 2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等第二十七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月第二十八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 2) 羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。 + 水溶性碳化二亚胺第二十九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月3)胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂： 丁二酮 二羰基化合物

13、 1，2环己二酮 苯乙二醛第三十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月第三十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月4)巯基的化学修饰 来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X E-SR +HXN-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）ESH 第三十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月5) 二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）第三十三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月氧化：过甲酸: Performic acid第三十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 6)咪唑基的化学修饰 来

14、源：His 修饰反应:酰基化与烷基化 酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化修饰剂：碘乙酸 + ICH2COOH + HI第三十五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月7）酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）第三十六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺 2-羟基-5硝基苄溴第三十七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸、丹磺酰氯

15、；2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂第三十八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 但解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。第三十九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月蛋

16、白质化学修饰的局限性化学修饰的专一性是相对的；酶的构象有些改变；化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行 。第四十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月（三）交联修饰（交联法） 用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。 分子间交联、分子内交联（四）固定化修饰（共价偶联法） 通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。第四十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） 蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋

17、白酶或肽酶为修饰剂）。 （与前面化学修饰区别） 第四十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。第四十三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月应用实例：1）提高酶活力：天冬氨酸酶用胰蛋白酶进行有限水解，从其羧基末端水解切除10多个氨基酸残基，可使天冬氨酸酶的活力提高4-5倍以上。2）消除抗原性：木瓜蛋白酶用氨肽酶进行水解，使其全部肽的2/3被去除，该酶的活力保持不变，而其抗原性却大大降低。第四十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月（二）氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。 （三）金属离子置换修饰 通过改变酶分子中所含的金