微生物学课件：细菌的形态学检查法

1、细菌的形态学检查法所谓细菌的形态学检查法是指利用各种显微镜，通过染色和（或）不染色标本，观察细菌的形态、大小、排列方式、特殊结构以及染色反应等，从而对细菌进行鉴定的一种手段。细菌的形态学检查法可分为不染色标本检查法及染色标本检查法。第一节 不染色标本检查法所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌的形态及运动状况的一种检查方法。这种检查方法虽可看到细菌的大致轮廓，但主要用于观察细菌的动力。一、不染色标本检查法的具体方法1、压滴法压滴法的主要步骤是：（1）、将纯培养的被检菌，接种于无菌肉汤或蛋白胨水中，经35、46小时培养，备用。（2） 、用接种环挑取上述培养液一环

2、，置于洁净载物玻片上。 (3)、在培养液滴上加盖盖玻片，静置5分钟后，用较暗视野的显微镜观察。结果：在显微镜的暗视野下，可见到发 亮的光点即为细菌。其中可发生位移的，说明细菌有动力（有鞭毛）；在原位颤动的，说明细菌无动力（无鞭毛）。用途：观察需氧菌和兼性厌氧菌的动力。 2、悬滴法 悬滴法的主要步骤是：（1）、将纯培养的被检菌，接种于无菌肉汤或蛋白胨水中，经35、46小时培养，备用。（2）、用接种环挑取上述培养液一环，置于洁净盖玻片上。（3）、取一洁净凹玻片，在凹窝周围涂凡士林油少许，然后双手平持凹玻片，将凹窝对准盖玻片上的备检菌悬液滴压下，此时盖玻片被凹窝周缘的凡士林油粘在凹玻片上。（4）、用

3、双手平持凹玻片，迅速翻转，使盖玻片向上盖在凹窝上，此时菌悬液滴呈自然状态悬在盖玻片下的凹窝中。 （5）、静置5分钟后，用较暗视野的显微镜观察。 结果：在显微镜的暗视野下，可见到发亮的光点即为细菌。其中可发生位移的，说明细菌有动力（有鞭毛）；在原位颤动的，说明细菌无动力（无鞭毛）。用途：观察自然状态下需氧菌和兼性厌氧菌的动力。 3、毛细管法（1）、将纯培养的被检菌，接种于无菌肉汤或蛋白胨水中，在厌氧环境中经35、46小时培养，备用。 （2）、取石蜡少许，加热溶解后备用。 （3）、取一洁净的毛细管，将其一端插入被检菌液，此时菌悬液被自动吸入毛细管中。 （4）、将毛细管的两端分别在已溶解的石蜡中蘸取

4、。 （5）、用透明胶带将已封固的毛细管固定在载物玻片上，静置后在显微镜下观察。 结果：在显微镜的暗视野下，可见到发亮的光点即为细菌。其中可发生位移的，说明细菌有动力（有鞭毛）；在原位颤动的，说明细菌无动力（无鞭毛）。 用途：观察自然状态下厌氧菌动力。 二、注意事项 1、观察细菌动力时，应选用新鲜的幼稚培养物，并在20以上的室温中进行。2、注意鞭毛运动与布朗运动的区别： 鞭毛运动：发生位移 布朗运动：原位颤动3、注意主动运动与被动运动的区别主动运动：多方向性运动被动运动：随水流方向单向移动第二节 染色标本检查法所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细菌进行染色，尔后再检查其形态、大小、排列方式、染色

5、反应以及特殊结构的一种检查方法。一、常用染色剂所谓染色剂就是能使细菌或细菌的某些成分着色的化学物质。染色剂的种类1、 按染色剂的来源分类：（1）、自然染色剂：所谓自然染色剂就是从植物、矿物或动物中提取后，仅加以纯化而不改变其化学结构的染色剂。此类染色剂目前被采用的种类不多，其中以胭脂红和苏木素应用较广泛。（2）、人工合成染色剂：所谓人工合成染色剂就是从植物或矿物中提取后，人为地改变其化学结构，从而增强其与被染物的亲和力的染色剂。细菌染色的染色剂，大部分是人工合成的有机染料，它们大多是从煤焦油中提炼出来的，它们都是苯的衍生物。也就是说，这些化合物的分子结构中都具有苯环。但只有苯环并不能使化合物呈

6、现一定的颜色，当苯环上的某一氢原子被一些特殊的化学基团（如硝基、亚硝基、亚氨基、硫基、对位醌基、偶氮基等）取代后，则可使化合物呈现一定的颜色。 从化学结构上可以看出，这些化学基团都有双键，双键不稳定，容易吸收一定波长的光而呈现一定的颜色。这种连接于苯环上的带双键的呈色的化学基团叫“发色基团”，简称为“发色团”或“色基”。“发色团”或“色基”越多，颜色越深。带有“色基”的苯衍生物叫“色原”或“色原物”。“色原”虽有色，但不一定能和被染物结合而着色，常需在染料分子中加上一个能电离的基团，使其能生成盐类而与被染物结合着色。这种结合在色原物上、能电离的化学基团称“助色基”或“助色团”。助色团具有能电离

7、的特性，可以和被染物结合而使被染物染上颜色。 常见的助色团有“OH”、“NH2”，其中“OH”是酸性的（因其电离后能放出氢离子）；“NH2”是碱性的。“OH”或“NH2”数量越多，则染料的酸性或碱性越强。如果两种基团各有一个时，则碱性占优势。因此，一般可按照助色团的性质，决定染料的酸碱性（即是酸性染料还是碱性染料）。2、 按电离后染料离子的性质分类（1）、碱性染料：此类染料电离时，染料离子带正电荷。如氯化美兰电离成CL 和美兰离子。 （MB+CL _ MB+ + CL）如美兰、碱性复红、结晶紫及龙胆紫等属之。细菌在一般环境中带负电荷，因而易与碱性染料结合，故碱性染料应用最广。（2）、酸性染料：

8、酸性染料电离时，染料离子带负电荷。如伊红的钠盐电离成Na+和伊红 。（EoNa+ Eo + Na+ ）伊红、酸性复红等属之。细菌含有大量的多种氨基酸，这些氨基酸均是两性化合物，氨基酸极性基带有正电荷的部分能与酸性染料结合。当培养基内糖分解使酸碱度下降时，细菌所带的正电荷增加，更易被酸性染料着色。（3）、中性染料：是酸性染料和碱性染料的结合物，如瑞特氏染料、姬姆萨氏染料等。在细菌学检验中这类染料应用较少。（4）、单纯染料：多数为偶氮化合物。此类染料化学亲和力低，不能和被染物结合形成盐类；不溶于水，但可溶于脂肪中，其染色力取决于能否溶于被染物，如常用于脂肪染色的苏丹染料即属此类。二、 细菌染色的一

9、般原理细菌染色的原理，目前有多种学说，但各种学说单独均不能圆满地解释细菌染色的原理。如果把各种学说归纳起来，细菌染色的原理可用物理和化学两大学说来解释。1、物理学说：这种学说认为，染料与细菌结合的过程（即染色过程）是一种单独的物理结合过程。在此过程中，没有新的物质生成。有实验表明：若把染色后的细菌放在水、乙醇或其他溶剂中长时间浸泡，最终可使细菌完全脱色。这一试验即为物理学说提供了有利的佐证。 物理学说认为，染料主要通过下述方式与细菌结合：（1）、扩散和渗透作用：细菌与染液接触后，染液中的染料可顺浓度差向周围扩散。由于染液中染料浓度很高而菌体内浓度很低，故染料可通过扩散和渗透作用经细胞壁和细胞膜

10、上的微孔进入菌体使细菌着色。（2）、溶解和吸收作用：染液和细菌接触后，溶解于其中的染料可被细菌摄取吸收进入菌体，从而使细菌着色。（3）、离子间的吸附作用：染料离子带有一定的电荷，可与菌体所带的异种电荷相吸附，从而使细菌着色。2、化学学说： 这种学说认为菌体内某些物质同染料结合即使细菌着色，在结合过程中可形成理化性质与原来不同的新化合物，且着色后不易为脱色剂所脱色。经染色后的细菌几乎全部死亡即为化学学说提供了有利的佐证。 物理学说和化学学说虽然能解释部分细菌染色的机理，但却均不能完全解释清楚。因此，多数学者认为，细菌染色的过程即非全是物理的，亦非全是化学的，而是两者相互结合、共同作用的结果。此外

11、，在染色过程中，细胞壁结构的完整性、细胞膜的通透性、培养基的成分、染液中的电解质量、细菌的种类、菌龄、环境的温度、pH值等，均可使细菌的着色受到影响。三、 细菌染色的一般程序细菌染色的基本程序是：涂片 固定 （媒染） 染色 （脱色）（复染）1、 涂片制备：随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。

12、2、 固定： 染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常不易使染料透入细胞内）。 固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。3、 媒染：媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使染料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的物质统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味酸、金属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之后复染之前进行。4、 染色：随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加染液以覆盖涂面为度，染色

13、时间随方法而定。单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀释石炭酸复红等；而多数染色法需用第二种染液进行复染。5、 脱色：脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为鉴别染色之用。凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负电荷，故可作碱性染料的脱色剂。6、 复染：已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。四、常用染色法

14、细菌的常用染色法有：单染色法、复染色法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光染色法等。（一）、单染色法： 单染色法是指用一种染料进行染色的方法。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。（二）、复染色法： 复染色法是用二种以上染料进行染色的方法。此法除显示细菌的形态、大小外，还有鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。常用的鉴别染色法有革兰氏染色法及抗酸染色法。1、 革兰氏染色法（Grams Stain）是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于18821884年发明的，至今已逾百年

15、，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法。（1）、革兰氏染色的方法：固定初染媒染脱色 （结晶紫或龙胆紫） （ 卢戈氏碘液） （95%酒精） 复 染 （稀释复红） 固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G”或“GN”（Grams Negative）表示。 革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操作技术及菌龄等有密切的关系。培养基成分：在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳性菌可变为革兰氏阴性菌。培养条件：在酸性环境中细菌带正电荷。操作技术：如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时倘

16、酒精作用时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。菌龄：菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为革兰氏阴性。（2）、革兰氏染色的原理革兰氏染色的原理目前有许多学说，如化学学说、物理学说、等电点学说、渗透性学说等。但任何一种学说单独均不能圆满解释革兰氏染色反应。综合各学说的观点，革兰氏染色反应的原理可能与以下因素有关：、 等电点学说细菌的主要组成成分是蛋白质。蛋白质是一种两性离子，它在pH不同的溶液中，其氨基端和羧基端分别带有不同的电荷。 由此可见：细菌在碱性环境中带负电荷，碱性环境越强，所带的负电荷越多； 细菌在

17、酸性环境中带正电荷，酸性环境越强，所带的正电荷越多。等点电学说认为，GP菌的等点电（pH23）比GN菌的等电点低（pH45），在接近中性的溶液中，GP菌所带的负电荷比GN菌为多，因此，更容易和带正电荷的碱性染料牢固地结合，不易被酒精脱色。此外，媒染剂碘为弱氧化剂，能降低GP菌的等电点，更扩大了两类菌的等点电差距。 、 化学学说这种学说认为：革兰氏阳性菌体内含有多量的核糖核酸镁盐与多糖的复合物，且这种复合物聚合程度高，分子量大，能牢固地与结晶紫及碘的复合物结合而着色；而革兰氏阴性菌核糖核酸镁盐含量甚微，核蛋白聚合程度较低，分子较小，分子吸附染料量也较少，故易被酒精脱色而成阴性。、渗透性学说 不同

18、的细菌其细胞壁和细胞膜的通透性不同。脱色剂酒精容易透入革兰氏阴性菌体内，溶解染料和碘的复合物使细胞脱色；而酒精不易透入革兰氏阳性菌体内，故不易脱色。革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少，与95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透性降低，使在细菌细胞内着色的染料结晶紫与碘的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏阴性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与95%酒精接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后使细胞壁通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又被染成红色。（3）、革兰氏染色法的临床意义、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为GP菌与GN菌两大类，这样可以

19、初步识别细菌、缩小范围，便于进一步鉴定。、了解细菌与致病性的关系：大多数GP菌的致病物质主要为外毒素；而大多数GN菌的致病物质主要为内毒素。通过革兰氏染色，可了解细菌的致病物质，从而做出相应的治疗对策。、选择抗菌药物：GP菌和GN菌在细胞壁等结构上有很大差别，因而对抗菌药物的敏感性不同。如大多数GP菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数GN菌对这几种抗生素不敏感，但对链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等敏感，故临床上可根据病原菌的革兰氏染色性，选择有效的药物进行治疗。2、 抗酸染色法有些细菌如结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆菌，用一般染色法不易着色，必须使用强染色剂（如石炭酸复红）并采用加热和

20、延长染色时间的方法才能使其着色。且一旦染上颜色后又不易被酸性酒精脱色。这种能够抵抗酸性酒精脱色的细菌，称为抗酸杆菌。应用这种原理进行染色的方法叫抗酸染色法。抗酸染色法常用的有萋纳二氏染色法和潘本汉氏染色法。（1）、萋纳二氏染色法、染色的步骤：固定初染脱色复 染石炭酸复红加热3%盐酸酒精 吕氏美兰染色过程中的细菌颜色变化： 抗酸杆菌 非抗酸杆菌、染色原理： 分枝杆菌的抗酸性主要是由于其菌体内含有大量的类脂如分枝菌酸所决定的。 石碳酸复红和盐酸酒精在分枝菌酸和其它物质中的溶解度 溶剂溶质 溶 解 度 分枝菌酸 其它物质石炭酸复红 高 低盐酸酒精 低 高由于石炭酸复红在分枝菌酸中的溶解度高于盐酸酒精

21、，所以不能被盐酸酒精洗脱；而其它细菌含分枝菌酸较少，故缺乏抗酸性。 、抗酸染色的意义：用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风杆菌）和非抗酸菌。（2）、潘本汉(Pappenheim)氏抗酸染色法、染液：a、 石炭酸复红染液：同萋纳二氏 （ZiehlNeelsen）抗酸染色法b、 附染液： 蔷薇色酸 1g 无水 乙醇 100ml 美蓝 加至饱和 甘油 20ml 、方法：a、 石炭酸复红加热染色2分钟；b、 倾去多余之染料，但勿以水洗；c、 加复染液于涂片上，并随即慢慢倾去；d、 重加复染液，如此反复45次；e、 水洗待干。、结果：结核杆菌为红色；耻垢杆菌 蓝色。（三）、特殊结构染色法细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易着色，须用一些特殊染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有荚膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染色法等。这些染色法不仅能使特殊结