细胞因子检测技术应用

1、细胞因子检测技术应用在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答B细胞 免疫），细胞介导的免疫应答（cell mediated immune response, CMI）也是人们所关注 的，而T细胞在CMI中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附 法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体K 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内 的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立 了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术 （ELISPOT

2、）。作为一项新型的免疫酶技每联免疫斑点法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT），是从单细胞水平检测分泌抗体细胞ASC）或分泌细胞 因子（CK）细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性， 易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分溉K细胞检测或ASC测 定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的 发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：（1）ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准

3、曲线比较得出可溶 性蛋白总量。（2）ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显 现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点 进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研 究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万 -30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素 单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用

4、几方面进行介绍。ELISPOT技术的发展（1）ELISPOT技术的过去ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年， 运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学 者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推 广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦迥细胞分 泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大 小，同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单，

5、但该技术并没能如预期地很快地被成功应 用在ex vivo T细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产 生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产 量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质 等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不 够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学 Paul Lehmann团队引进 PVDF薄膜的应用(Forsthuber et al., Science, 1996)，才釜 底抽薪地解决了

6、该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相 比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因 子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高 ELISPOT Cytokine分析的敏感度。第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实 证，也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基 础但很重要的问题，诸如；实验所得的斑点是抗原特定1细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效 应？斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？能否相信斑点是由单一

7、的细胞造成？ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围？如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？ELISPOT技术的现在1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁等技术改良，ELISPOT分析技术已经逐 渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特茴细胞的体外检测技术。藉 由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹，ELISPOT分析技术可提示T细胞 免疫系统的两个重要参数：抗原特定！细胞的clone族群大小；和免疫效应细胞的信 号传导路径Th1/Th2。多年来经过数十个研究团队的致力研究，对于ELISPOT分析技术本身的

8、几个问 题，也有了科学上的验证。目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平 上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。在适当的实验 设计下，ELISPOT Cytokine斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑 点形态学与Time Response分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。也 因为如此，ELISPOT是个免疫学上的标竿技术，它可以允许科研人员在几乎自然生理 条件下，观察细胞实际分泌Cytokine的进程，进而可以得到药理学信息，阐明免疫调 节药物如何影响T细胞分泌各类cytokine的速率。药物抑制T细胞免疫一般可通过两

9、程截然不同的机转；使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小，或减少每 Precursor T细胞的cytokine产能，而ELISPOT技术能提供双份信息。ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特茴细胞免疫学上独占鳌头。此 技术是当世唯一准许百万分之一 1:1000,000的准确分析，如此强效的解析力使流式细 胞技术也望其项背，以目前国内外常规的intracellular cytokine或者 Dimer/ tetramer 染色，流式技术的灵敏度一般限制在1:10,0000这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究 是必须的，因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频

10、率通常低于万中取 一。此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球，解冻后 PMBC与新鲜分离样品有相当的效价，没有丧失功能。这一点对临床试验非常重要，它 使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样，如果试验牵涉全国多个临床试 验机构，病人血样可冰存并同时集中在中央实验室一齐被测试。同理，一个血样 或标准对照品可被分装小份，被送到不同检验中心进行测试，以交互比对，同时有利 LISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化ELISPOT未来展望ELISPOT分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接 洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，

11、就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经 由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到 全新的智识。从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地 应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)肿瘤(Nagorsen, 2000)或自体免疫病人体内的一个特定 的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。E

12、LISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验 中，被当成重要的终结指针。2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合 作，将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划将是首次利 用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。我们期待未来 此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。原理ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样 的，理解起来并不难。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆 抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性 磷酸酶标记的亲和素结合。BC

13、IP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现紫色”的斑点表 明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。 传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理，通过酶的高催化频率，放大反 应效果，从而达到很高敏感度的检测效果。ELISPOT全名为 Enzyme-linked Immunospot Assay,其技术原理与ELISA相 似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒 性（不含sodium azide内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分 离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激

14、，并将微孔盘放置于温箱中 过夜培养一段时间。一般而言，记忆致细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞 激素，此时局部（在紧靠分泌细胞的周围）分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体 捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素 （Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加 入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。反应步骤可大致分为：（1）利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点；（2）加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞 因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结

15、合；（3）洗掉细胞；（4）加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个 细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计 算出样品中被激活细胞的数目。以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需 把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。目前，ELISPOT已被用于检测药物、化学制剂及其它复合物的特性及功能等方面 因此为体内免疫功能的调节效应提供了检测依据。近几年来ELISPOT技术在肿瘤疫苗 评价试验、免疫监测及免疫学研究中越来越被广泛地使用。在抗肿瘤免疫及相关领域中的应用在许多研究电该技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特

16、异的细胞毒T寄细 胞(CTL)的数量检测。近期ELISPOT技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC中 检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异KT细胞的疫苗试验。ELISPOT检测T细胞反应时敏感性、特异性和可重复性都很高操作简单迅速需要 少量标本，在检测抗原特异性细胞数量的同时也反应其功能并与临床结果相关。 ELISPOT平板可以提前大量准备移液、洗板和读板都可自动化因而大批量检查也可做 到快速高效。在与与其他方法的比较后ELISPOT很可能成为定量分析肿瘤或病毒特异 性的T细胞反应的首选。在抗感染免疫中的应用CTL在抗病毒感染的免疫应答中占有主要地位而CD4+辅助性T细胞亚群

17、Th1/Th2 的平衡在抵御病毒感染中起着同样重要的作用。在HIV研究方面由MHC-1类分子加 工的不同抗原经CTL识别并产生免疫应答在控制HIV-1感染中同样起重要作用。利用 ELISPOT方法检测CK如IFN2赫可以进一步了解到针对HIV特异的CTL应答及相关 免疫信息。此外,ELISPOT法还用于评价由HIV-1感染引起粘膜的CD4+T细胞免疫应答以及 HIVgp 120g与霍乱毒素共表达的DNA疫苗的免疫源性。在其他研究中ELISPOT还用 来检测通过直肠免疫低剂量甲肝疫苗而产生的细胞免疫应答。在急性的自限性肝炎中 以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫且在控制病毒感染及延缓慢性疾病的发

18、展方面 有重要作用。在许多抗细菌免疫研究由该方法也发挥了重要作用。例如：应用ELISPOT试验证 实表达大肠杆菌MalE蛋白的重组卡介苗(rBCG.MalE)诱导的T细胞应答是CD4+T细胞 依赖的,rBCG.MalE诱导的特异CD4+T细胞应答存在Th1/Th2平衡转换现象并逐步形 成Th1/ Th2混合应答。细胞因子检测技术的临床应用目前，已经实现临床检验的领域是对肺结核(TB)的检测。而最近的研究热点就是 对于移植的预测。受体对供体特异性HLA抗体一直以来都是器官移植的一大障碍因为 它们的存在不仅介导超急性排斥反应而且还可导致急性排斥反应。因此HLA抗体的存 在限制了异体抗原敏感患者对供体器官的需要因而增加了等待移植的时间。在心月翩干 脏和肾脏异体移植后早期出现的并发症如急性排斥反应与移植前存在的异体免疫临床 相关性迫切需要一种恰当的检测方法在器官移植前能了解受体对供体特异性体液免疫 的功能状态。在接受移植的人群中，部分因有多次输血、或既往有异体移植失败或多次妊娠史体 内曾经存在阳性异体抗体在他们接受异体移植时现有的检测方法只能显示他们对异体 的免疫功能正常。但他们体内存在记忆B淋巴细胞一旦受到相应HLA抗原的刺激则会 唤起免疫反应这不仅影响着移植的结果甚至会出现危及患者生命的、与移植相关的并 发症。ELISPOT是一种强有效的检测单个抗体分泌细胞的方法具有很高的敏感性。因