MMFSCNJ出口蜂产品中四环素族残留量

1、MM_FS_CNJ_0253口蜂产品 四环素族 残留量 微生物牛津杯法MM_FS_CNJ_0253出口蜂产品中四环素族残留量适用范围本方法适用于出口蜂王浆和蜂蜜中四环素族残留量的检验。原理概要蜂王浆样品溶解于三氯乙酸或柠檬酸后，经离心去除样品中的蛋白质，然后用乙醚除去蜂王浆中的癸烯酸等天然抗生物质。通过色谱柱内的树脂吸附和解 脱，用微生物牛津杯法进行鉴别试验，与标准比较进行定量。蜂蜜样品经溶解后，直接通过色谱柱内的树脂吸附和解脱，以下检验的操作与蜂王浆相同。主要试剂和仪器主要试剂乙醚、甲醇、三氯甲烷以及正己烷；甲醇溶液： 60%(V/ V) ；柠檬酸缓冲溶液： pH 4.0 ；三氯乙酸溶液：2

2、%(V/ V) ；柠檬酸溶液： 2%(V/ V) ；氯化钱-磷酸溶液：称取1.0g氯化钱，吸取2mL85%|酸液，量取160mL蒸储 水配制而成；氢氧化钠溶液： 40%(m/ m) ；磷酸盐缓冲溶液： 0.1mol/L 。 pH4.5， pH8.0；准确称取13.6g磷酸二氢钾置于950mLTK中溶解，用氢氧化钾或磷酸二氢钾调节 至pH4.5和pH8.0,然后加水至1 000mL;生理盐水：0.85%的氯化钠溶液；吸附树脂 XAD-2(Amberlite ，苯酚甲醛离子交换树脂 ) ；处理方法：用甲醇浸泡30min以上，然后用水以倾析法洗涤 56次，浸泡于水 中备用。抗生素标准品：四环素(TC

3、), 土霉素(OTC),金霉素(CTC)。由国家卫生部药 品生物制品检定所规定之标准品；抗生素标准贮备液及工作溶液：抗生素标准贮备液：准确地分别称取 0.050 0g(精确至0.000 1g)抗生素TC, OTCf口 CTC供效彳介为1 000单位/mg),各用0.01mol/L盐酸溶液溶解后并定容至 50mL抗生素标准溶液为1 000 Ng/mL。配置后在冰箱中保存，在一周内使用。 如抗生素标准品的效价低于1 000单位/mg(1单位=1(1g)。配制时，则换算为 1 000 单位 /mg；抗生素标准工作液：在工作时，吸取抗生素标准贮备液，用 pH4.5磷酸盐缓 冲液稀释配制成 0.05、0

4、.10、0.20、0.40、0.80、1.0和2.0仙g/mL的抗生素 标准工作液；色谱用的展开剂：正丁醇+乙酸+水=4+1 + 5或 正丁醇+甲醇+水=4+1+2培养基及菌种制备：菌种用培养基：胰蛋白胨 .10.0g ；牛肉膏.5.0g ；氯化钠.2.5g ；琼脂.14.0 16.0g ;蒸馏水.1 000mL ；制备时，将上述ad各组成分加入e中，搅拌加热至溶解。于121C,高压 灭菌 15min,最终 pH为 0.5 0.1 ;检定用培养基：胰蛋白胨 .6.0g ；牛肉膏.1.5g ；酵母膏.3.0g ；琼脂.14.0 16.0g ;蒸馏水.1 000mL ；制备时，将上述ad各组成分加

5、入e中，搅拌加热至溶解，经121c高压灭 菌 15min,最终 pH为 5.8 0.1 ;试验菌种：蜡样芽孢杆菌 （Bacilluscereus Varmycoides） ，菌种号 63301， 由国家卫生部药品生物制品检定所规定的菌种；菌种培养：将菌种安瓿瓶管的上部敲碎后，加入少量肉汤培养基，使其溶解并移至肉汤管中混匀。置于30 1C培养24 ho取菌种单个菌落接种于菌种培养基中。采用试管斜面或克氏瓶内培养， 置于 30 1培养1 周。 镜检芽孢菌数达到85%以上，便可制备芽孢悬浮液；芽孢悬浮液制备：用适量灭菌的生理盐水洗下菌苔，于 65恒温水浴中加热30min， 再以 2 000r/min

6、离心20min,弃去上清液，重复23次。最终用适量的灭菌生理盐水稀释， 即为芽孢悬浮液，置于冰箱中保存使用。有效期为一个月；平板制备：于灭菌后冷却至5055c的检定培养基中加入适量的菌液（如抱子悬浮液中 的菌数在107个/mL时，则按约0.1%量加入；如果106个/mL时，则按约0.5咐口 入，使0.05 （ig/mL的TC标准液抑菌圈直径达到12mm）混匀后，立即注入平 板。每个平板直接注入检定用培养基6.0mL,凝固后备用。仪器培养皿：内径90mm底部平整光滑的玻璃皿，或塑料皿上用陶瓦盖；牛津杯：外径80.1mm内径6 + 0.1mm1高100.1mm的不锈钢杯，重量误差不超过 0.05g

7、 ；游标卡尺：测量范围，0150mm精度为0.1mm长方形培养皿：1.5cm X8cmX 23cm；色谱柱：内径1cm,长30cmi具有活塞调节流速；层析柱的制备：先用少许玻璃棉置于柱的底部，然后加入经处理的 XAD-2 树脂15mL树脂上端加入少许玻璃棉，并用 300mL*,以150mL/h流速洗柱后备用；色谱缸：20cmx 15cmx 30cmi微量注射器：10L或50仙L;半对数方格纸。离心机：转速范围04000r/min ；旋转式真空浓缩器；恒温培养箱： 30 1，隔层置玻璃板并调节水平位置；恒温水浴锅；高压灭菌器；水平台，带水平器；色谱纸：6cmx 20cm过滤纸；分液漏斗。氮气：纯

8、度99.99%;其他玻璃器皿。试样的抽取与制备检验批蜂王浆以每一生产缸（ 约 300kg） 为一检验批。蜂蜜以不超过1000件为一检验批。同一检验批的样品，应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。抽样数量对蜂王浆，每一生产缸取一份样。对蜂蜜，不超过 50件包装取5件；51 100件，取10件；101500件，每增加100件，增取5件；501件及以上，每 增加100件，增取2件。每件抽取样品不少于100g,作为原始样品。抽样工具取样器：不锈钢匙。不锈钢管，长约115cm直彳约2.5cm,或带活塞玻璃管；混样器：搪瓷桶或杯；单套杆：不锈钢制；样品瓶：100mL 500mL磨砂盖广口玻璃

9、瓶。抽样方法蜂王浆：按每缸的上、中、下三个部位抽样，样品混匀后，装入样品瓶内，标明标记并及时送实验室冰箱中保存。蜂蜜：按 4.2 的抽样件数随机抽取，逐件开启。将玻璃取样管缓缓放入，吸取样品。如遇蜂蜜结晶时，则用单套杆或不锈钢取样管插到底，抽取样品。将所取样品倾入混样器，混和均匀，装入清洁的样品瓶内，加封后，标明标记，及时送实验室。试样制备蜂王浆样品从冰箱中取出后，在室温下融化，搅拌均匀。蜂蜜中未结晶的样品将其用力搅拌均匀， 对有结晶析出的样品可将样品瓶盖塞紧后，置于不超过40的水浴中温热，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。上述蜂王浆及蜂蜜试样均分成两份，装入

10、洁净容器内，密封，并标明标记。试样保存蜂王浆：将试样于 18冷冻保存。蜂蜜：将试样于室温保存。注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。过程简述样液提取蜂王浆样液提取准确称取5.0g（精确至0.1g）蜂王浆于小烧杯中，用80mL2喔氯乙酸溶液分 数次溶解。 定量地移入离心管中， 以 2000r/min 离心 10min。 将上清液移入250mL分液漏斗中。下层沉淀物再分别加入 40、20mL2%氯乙酸溶液搅匀后离心，合 并上清液于分液漏斗中。上述上清液分别用60、60和30mL乙醴振摇，提去癸烯 酸，弃去上层乙醚，将下层水溶液收集于烧杯中，用40%氢氧化钠溶液调

11、节pH至4.5,并加入pH4.5磷酸盐缓冲溶液60mL备用。或准确称取蜂王浆5.0g（ 精确至 0.1g） 于小烧杯中，加入100mL 2%柠檬酸溶液，摇匀后，加入100mL氯甲烷，振摇后移入离心管中，并以 2000r/min离心 10min。弃去下层三氯甲烷，加入100mL乙醴，充分振摇，离心后弃去上层乙醴 层。再加100mL乙醴重复一次。于留下水相中加入20mL氯化钱-磷酸溶液，用40%氧化钠?液调节pH至5.0,再加入100mLE己烷，振摇后离心。去除正己 烷层，用氮气流吹除样液中有机试剂。将经上述步骤中任一种提取的试样溶液，移入装有XAD-2树脂的层析柱中，并以 100mL/h 的流速

12、过柱， 使样液中的四环素族被吸附。 四环素族被树脂吸附后，用200mL蒸储水洗柱，流速控制为150mL/h。继用90mL 60刈醇洗脱四环素族， 其流速为90mL/h,并用甲酉!定容至100mL#用。蜂蜜样液提取准确称取约50g（精确至0.1g）蜂蜜于300m设杯中，加入200mLpH4.0柠檬 酸缓冲溶液， 搅拌均匀， 使试样充分溶解后， 用 2%柠檬酸溶液或40%氢氧化钠溶液调节溶液pH至4.5,并加入60mLpH4.5磷酸盐缓冲溶液。然后移入装有XAD-2 树脂的色谱柱中，以100mL/h流速过柱，使样液中的四环素族被吸附。以下操作 步骤与上述蜂王浆的步骤相同。收集甲醇淋洗液于100mL

13、容量瓶中,并用60%ff醇定容至刻度，备用。定量试验标准曲线绘制取 5个试验用的平板， 每个平板上放5 个牛津杯， 分别注满 0.05、0.10 、0.20 、0.40和0.80 Ng/mL的TC标准工作液，并于30 1C培养201 h。然后测量各 浓度的TC的抑菌圈直径，求得各自的平均值，并经回归方程校正后，在半对数 纸上，以抑菌圈直径为纵坐标， TC 浓度为横坐标，绘制标准曲线。每次试验时都需制备相应的TG OTC CTC标准曲线。样液的定量试验准确吸取50mLM王浆的甲醇提取液于梨形瓶中；而蜂蜜仅取10mL的甲醇提取液。在40减压浓缩至干后，准确加入5.0mL pH4.5 磷酸盐缓冲液，

14、使浓缩物被溶解。此样液中，相当于蜂王浆试样浓度为0.5g/mL ，相当于蜂蜜试样浓度1.0g/mL 。取5个试验平板，每个平板放 4个牛津杯。每板分别注满一个 0.05 Ng/mL 和一个0.10仙g/mL的TCfe准工作液及二个蜂王浆试样提取液或二个蜂蜜试样提 取液。置于30 1培养箱培养20 1 h 后，测量抑菌圈直径，分别求得它们的平均值。经校正后，检液的抑菌圈大于12mniM,应进行鉴别试验并按标准曲线计算出检液中的TC含量。如果检液的抑菌圈小于 0.05祖g/mL的TC标准液的抑 菌圈时，则可报告为“未检出抗生素” 。试验不用进行下去。鉴别试验加热分解反应试验取50mLt王浆的甲醇提

15、取液,而对蜂蜜则取 10mL的甲醇提取液，置于犁形 瓶中，于40c减压浓缩至干。加入 5.0mL pH8.0磷酸盐缓冲溶液，备作加热分 解反应。取2支刻度试管，每管加入2.5mL上述溶液，其中1支置于沸水浴中， 加热30min,然后用1mol/L盐酸溶液调节2支试管内检液至pH4.5,再用pH4.5 磷酸盐缓冲溶液分别定容至 5.0mL。同时于2支刻度试管中分别吸取 2.5mL0.2 卜g/mL的TC标准工作液(用pH8.0磷酸盐缓冲溶液配制成)，按试样提取液同样 操作，最终定容至？.0mL。取2个平板，各放4个牛津杯，每个杯中分别注入加热检液、未加热检液、加热后的TC标准工作液和未加热的TC

16、标准工作液。然后将平板置于30 1C培 养20 1h,观察和测量各抑菌圈直径。在未加热的0.1仙g/mL TC标准工作液呈现出正常的抑菌圈，而加热的0.1(1 g/mL TC标准工作液不出现抑菌圈的条件下，说明人工合成的抗生素在加热中 被分解破坏。因此，未加热检液的抑菌圈直径在12mn上，而加热检液的抑菌圈直径在10mmz下，可初步推定检液中含有 TC族抗生素，并需作定性试验。 5.3.2.定性试验本法采用微生物色谱法进行定性试验。用pH4.5磷酸盐缓冲溶液喷涂于色谱 用纸(7cm x 22cm)上，自然干燥后备用。定性试验的检液的制备，如是蜂王浆试样，准确称取5.0g试样后按5.1.1中样液

17、提取的操作步骤进行，收集 100mL甲醇提取液于40c减压浓缩至干，用 0.1mL甲醇溶解。如是蜂蜜试样，按5.1.2样液的提取操作步骤进行，所收集的 100mL甲醇提取液中，吸取20mL置于40c减压浓缩至干，用0.1mL甲醇溶解。取TC和OTCfe准工作液的浓度为2.0仙g/mL, CTC勺标准工作7W勺浓度为1.0 g/mL,以及定性用的试样提取液各1020 pL,分别用微量注射器吸取并点在 上述备用滤纸上。将滤纸移放在盛有展开液的色谱缸中，展开35 h后，取出。待溶剂挥发后，将滤纸轻轻贴在事先加有60mL含有菌液的检定用培养基的长方形培养皿中，移至4c的冰箱中放置1 h 0取出培养皿，弃去滤纸，将培养皿置 于30 1C进行培养201 h0根据培养皿中培养基上出现的抑菌圈的位置，测 得各抗生素的Rf值，对照标准，以确定被检试样中所含 TC族抗生素的种类。 6.结果计算检液的抑菌圈平均直径小于 0.05 pg/mL的TC标准工作液抑菌圈平均直径 的，可以结束试验，出具结果为“未检出抗生素”。2.如在定量试验中，检