2022液体活检在癌症筛查全文

1、2022液体活检在癌症筛查（全文）癌症目前已成为我国居民的首要死亡原因,且其发病率和死亡率还在 不断攀升。据国际癌症研究机构数据显示：我国2020年有约457万 例新发癌症病例和300万例癌症死亡病例，分别占全球新发癌症病例 的24%和癌症死亡病例的30%。并且,我国癌症的整体5年生存率与 美国相比有较大差距（40%比67% ）,主要原因是我国大局部癌症患 者在确诊时已属中晚期，预后较差。以肺癌为例，低剂量螺旋CT （low-dose computed tomography , LDCT ）的推广使美国肺癌高 风险人群肺癌死亡率降低了 20% ,全因死亡率降低了 6.7% ;也使我 国高风险人

2、群中肺癌的检出率提升了 4倍左右（1.5%比0.3% ）。由 此可见，早筛、早诊、早治是提高癌症患者生存率的关键。从卫生经济学的角度来看，癌症早期发现可带来经济效益。广州市结 直肠癌经济负担调查显示，不同分期结直肠癌患者的医疗费用水平差 异存在统计学意义（A0.001 ）:癌前病变的费用最低，IV期平均费用是I期的2.7倍，癌症筛查可以提高早期患者比例，降低医疗费用。2020年,国家癌症中心对结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、食管癌和胃癌等6种常见癌症现有筛查方式的卫生经济性进行了系统评价，结果显示：以每挽救一个生命年的增量本钱计算，食管癌筛查最为经济有效，其次分别为结直肠癌、有效，其次分别为结直

3、肠癌、胃癌和乳腺癌。癌细胞在生长、坏死、凋亡的过程中，会释放一些癌症信号到体液（包括血液、尿液等）中，通过检测体液中的癌信号可以早期发现癌症。但同样发现其检出癌前病变的效能缺乏，灵敏度仅为33.3%。相较于 独立的甲基化位点，基于多靶点甲基化检测的机器学习模型在多项研 究中展现出更高的灵敏度(83.6%87.9% )和相似的特异度(83.3%91.9% )。其他结直肠癌血液标志物包括血清蛋白与多糖、血清miRNA和cfDNA片段图谱等，但尚缺乏前瞻性研究验证。总体 来说，现有液体活检标志物在进行结直肠癌早筛中已取得较大突破, 但在识别癌前病变方面尚待改善。(三)肝癌、胰腺癌美国国家综合癌症网络

4、(national comprehensive cancer network , NCCN )指南推荐肝癌发病风险升高的人群(如肝硬化、慢性乙肝等) 每6个月进行一次超声检查，可同时进行甲胎蛋白(alpha fetoprotein , AFP )检测。然而超声检查在肝癌早期缺乏良好的灵敏度，仅凭AFP 检测易造成漏诊和误诊。传统血清学检测还包括甲胎蛋白异质体3与 异常凝血酶原等，但单独检测效能缺乏，需三项联合或结合B超。多项泛癌种研究说明，与其他肿瘤相比，早期肝癌cfDNA释放入血信 号最强，这使得cfDNA成为早期肝癌筛查潜在的理想选择。2017年 Xu等筛选出10个甲基化标志物建立肝癌的综

5、合诊断模型，该模型可 有效区分肝癌和健康人群，灵敏度为83.3% ,特异度为90.5% ,且诊 断早期肝癌效能优于AFP。考虑到区分肝病患者对于肝癌早筛的重要性，Luo等基于cfDNA甲基化标志物建立的模型可有效区分肝癌、肝 硬化和健康人群，灵敏度为83.6%，特异度为96.0% ,有助于实现肝癌高危人群的早预警、早诊断和早治疗。5-羟甲基胞口密咤与基因调控 和肿瘤发病机制密切相关，通过将5-羟甲基胞口密碇与末端序列、片段 分布和核小体印迹特征相结合构建的肝癌诊断模型，灵敏度和特异度 分别为95.4%和98.0% ,对于极早期和早期肝癌的筛查灵敏度相比AFP同期提升了 3倍，比异常凝血酶原提高

6、了 70%o除了 cfDNA ,血 清miRNA作为诊断肝脏疾病潜在的生物标志物一直很受关注，Zhou 等筛选出 7 个 miRNA 组合 miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、 miR-26a、miR-27a和miR-801），区分肝癌患者与健康人群的灵敏度到达83.2% ,特异度为93.9% ;基于此结果,团队自主研发了全球 首个7种微小核糖核酸肝癌检测试剂盒，并于2017年获得国家药 品监督管理局的三类器械注册证和生产许可证。液体活检相关的标志 物在肝癌早期筛查展现出了较好的灵敏度和特异度，但目前仍缺乏无 病症高危人群前瞻性的数据。FDA于2021年4月授予Blu

7、estar Genomics公司无创胰腺癌早筛突 破性医疗器械”认定，该产品通过检测cfDNA上羟甲基胞口密碇的变化, 用于在新发糖尿病患者中筛查胰腺癌。除cfDNA外，Schultz等发现 联合不同的循环血miRNA构建检测模型,灵敏度可达85.0%，特异 度到达64.3%85.4%。此外，循环外泌体在胰腺癌早筛中的潜在作用 已成为另一研究热点。Yang等鉴定了基于循环外泌体的蛋白标志物谱, 包括 G6?、EpCAM、MUC-1、GPC-1 MV72,检测胰腺癌的灵 敏度和特异度分别为86.4%和81.0% ,目前此种筛查方法的缺乏在于 缺乏高特异度的鉴别方法将循环外泌体别离。除了血液，胰液

8、和唾液 等其他液体样本在胰腺癌的早筛中也发挥着重要作用。(四)乳腺癌早期乳腺癌患者血浆cfDNA中可以检测到存在于组织中的突变。Zhang等基于靶向二代测序技术对乳腺癌患者血浆样本进行ctDNA 突变检测，I田期患者的检出率为69.2%76.7%。当与影像学检查 结合后，整体灵敏度并未有显著提升，仅为74.2%。突变作为乳腺癌 早筛标志物结果不够理想，局部原因可能来自于血液中ctDNA突变丰 度低而导致的检测受限。而血液中cfDNA甲基化位点丰富，Liu等基 于全基因组亚硫酸盐测序技术，构建了基于cfDNA甲基化评分的早期 乳腺癌诊断模型，能有效诊断早期乳腺癌，曲线下面积(area under

9、 curve , AUC )为0.81。将模型与影像学检测结合后，诊断效能得到 进一步提升(AUC = 0.93 )，灵敏度和特异度分别为91.7%和88.0%。 多个miRNA联合可以进一步提高模型诊断效能，Chan等发现血清 miR-L miR-92a、miR-133a和miR-133b分别具有较高的乳腺癌 诊断效能(AUC = 0.780.87 ),而其中两项结合建立的乳腺癌诊断模 型AUC可提高到0.900.91。2021年11月，分子肿瘤学机构Datar Cancer Genetics宣布FDA授予其基于血液CTC的检测产品突破性 医疗器械认定，或可用于乳腺癌早筛。未来，液体活检多组

10、学如何 整合不同生物标志物的优势，与目前的标准护理模式结合进一步提升 乳腺癌早筛的效能，值得深入探索。(五)妇科肿瘤高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus , HPV )感染是宫颈 癌最主要的致病因素。国际癌症研究机构专家认为HPV核酸检测是其 首选的筛查方式。目前还可基于外周血和尿液等样本对HPV的信使 RNA或蛋白进行检测，且对宫颈癌以及子宫颈鳞状上皮内病变 (cervical intraepithelial neoplasia , CIN )均有一定的检出率。3351丫检测试齐1盒是FDA批准的首个用于HPV一线初筛的产品， 检出CIN3 +的灵敏度达92.0%

11、,高于液基细胞学检查的53.3%。除了 HPV感染外，宫颈癌的发生还与关键基因突变(如PIK3CA、力53和 KRAS需)及甲基化异常密切相关，这些可作为潜在有效的宫颈癌或癌 前病变筛查标志物。约翰霍普金斯大学癌症中心开发出一项针对卵巢癌和子宫内膜癌的筛 查技术，该技术使用多重聚合酶链式反响(polymerase chain reaction , PCR )联合检测常规巴氏涂片检查的宫颈液样本中18个基 因的突变情况及染色体非整倍数的变异情况，检出子宫内膜癌和卵巢 癌的灵敏度分别为81%和33% ,特异度约为99%。被检出的患者中 有78%的子宫内膜癌患者和34%的卵巢癌患者处于癌症早期。针对

12、突变的卵巢癌高风险人群NCCN指南推荐在适当年龄 进行预防性输卵管卵巢切除术；针对一般风险人群，尚无任何指南或 专业机构推荐进行卵巢癌常规筛查。有研究说明，采用靶向亚硫酸氢 盐测序技术构建的3个DNA甲基化血清标志物组合可在临床诊断前 两年检测到卵巢癌，灵敏度和特异度分别为57.9%和88.1% ,筛查早 期卵巢癌灵敏度优于糖类抗原125( carbohydrate antigen ,CA125 ) (57.9%比42.1% )，但特异度较低(88.1%比95.5% )。此外， Kandimalla等发现采用miRNA联合模型筛查卵巢癌优于单独使用 CA125 ,并在回顾性(I期患者中AUC=

13、0.96，总AUC = 0.89 )和前 瞻性队列(AUC = 0.92 )中均得到很好地验证。值得关注的是，获FDA 批准的0VA1早筛试剂盒基于CA125在内的5种术前血清标志物构 建了卵巢恶性肿瘤风险评分，以此确定在术前需要转诊至妇科肿瘤专 家的患者，但尚未有指南推荐作为卵巢癌筛查或独立诊断工具。(六)泌尿系统肿瘤肾细胞癌约占肾癌的80% ,死亡率高，有50%60%的患者在确诊前 无明显病症，目前临床上并无有效的筛查手段，因此液体活检在肾细 胞癌早筛中的探索越来越受到研究者们的关注。Nuzzo等利用cfDNA 甲基化免疫共沉淀测序准确地区分了肾细胞癌患者和无癌对照组 (AUC = 0.9

14、9 )。为了证实cfDNA甲基化免疫共沉淀测序对尿液的作 用，研究者对受试者的尿液cfDNA进行了相同方法的分析，平均AUC 为 0.86。膀胱癌的常见临床病症是肉眼血尿,局部患者仅表现为显微镜下血尿 及刺激性排尿，临床上需要进行膀胱镜及必要的影像学检查确诊。目 前基于尿液和血液的生物标志物可以作为膀胱镜检查的有效补充手段。 Chen等基于两个尿液DNA甲基化位点建立并验证了区分膀胱癌患者 的模型,灵敏度和特异度分别为90.0%和83.1%0该方法在灵敏度上 同尿液细胞学和荧光原位杂交检测(fluorescence in situ hybridization ,FISH )方法相比得到大幅提高

15、，特别在早期膀胱癌中， 灵敏度为64.5%，而尿液细胞学和FISH检测方法仅为11.8%和15.8%O 除了 cfDNA , Shimizu 等发现了 4 个血液 miRNA 位点(miR-137、 miR-124-2. miR-124-3和miR-9-3)可以较好地区分膀胱癌，灵敏 度和特异度分别为82.0%和91.0%。前列腺癌筛查中国专家共识(2021年版)中建议对身体状况良好， 且预期寿命10年以上的男性开展前列腺特异度抗原(prostate-specific antigen , PSA )筛查。PSA 虽然降低了前列腺 癌的死亡率，但是不能区分良性和低级别的肿瘤，会导致过度诊断。 2

16、015年，Gronberg等利用临床变量(年龄和前列腺活检)、血浆蛋 白浓度(PSA、游离PSA、人激肽释放酶2、阳微精蛋白和生长分化 因子-15 )以及源自单核甘酸多态性的多基因风险评分对前列腺癌进行 筛查，该模型AUC显著优于单独使用PSA筛查（0.74比0.56 ）;且 在高危受试者中，该方法比PSA降低了 44%的良性疾病活检次数以及 32%的总活检次数，并且不影响前列腺癌的检出率。另一方面,液体 活检在前列腺癌筛查中的应用也在不断尝试商业化，一种基于尿液外 泌体基因表达的检测方法开发用于鉴别高级别、低级别和良性前列腺 癌，进一步改善了适用人群高级别前列腺癌的识别效能，减少了不必 要的

17、活检次数。（七）血液肿瘤血液肿瘤早期预后优于中晚期，如非霍奇金淋巴瘤I期患者5年生存 率约90% ,而IV期患者仅约60% ,同时，Li等发现利用M蛋白筛查 出的骨髓瘤患者预后优于病症驱动的患者（3年总生存率：76.9%比 46.6% ）,以上均提示血液肿瘤早筛的必要性。2021 年,Gupta 等设计了基于 MYD88、TERT启动子、IDH 1/2、H3F3A 和8抬尸突变的快速多重基因分型检测方法，帮助诊断和鉴别诊断原 发性中枢神经系统淋巴瘤和其他神经系统肿瘤，灵敏度为57.6%，特 异度为100%。另外，多项研究发现循环miRNA可作为血液肿瘤诊断 的潜在生物标志物。2020年Ann

18、O/?co/公布了一项基于cfDNA甲基化技术的泛癌种早筛 的研究。在99.3%特异度下，I期淋巴瘤的灵敏度接近60% , H-IV 期均超过75%0在另一项独立验证研究中，在99.5%特异度下，浆细 胞肿瘤的灵敏度为72.3%0基于回顾性研究的良好结果，GRAIL公司 进一步启动了首个基于泛癌种早期检测的前瞻干预性研究，在准确检 测出的29例癌症患者中，有12例为血液肿瘤患者，值得关注的是, I口期淋巴瘤的检出率更高。针对血液肿瘤早筛技术的探索与开发是目前临床需要重视的问题，特 别是在淋巴瘤和浆细胞肿瘤中，现有泛癌种的数据提示我们基于 cfDNA甲基化建立早筛模型的可行性，但由于样本量有限且

19、单癌种需 要进一步考虑灵敏度和特异度的选择，因此还需要在更多的临床研究 中获得验证。（八）其他癌种EB病毒相关标志物是目前临床应用最广泛的鼻咽癌筛查诊断标志物。 一项前瞻性研究利用血浆EB病毒DNA载量对鼻咽癌患者进行监测， 最终发现的I期和口期患者占比达71% ,显著优于历史队列，灵敏度 和特异度分别为97.1%和98.6% , PPV和NPV分另为11.0%和 100.0%。止匕外，多项研究说明EB病毒编码的miR-BARTs相堇成为 鼻咽癌新的诊断标志物，但仍需大样本研究验证，并制定相应的判定 标准。目前，如何更精准地锁定发病高风险人群提高筛查方法的PPV , 是鼻咽癌二级预防亟待解决的

20、问题。近期，中山大学肿瘤防治中心的 研究团队提出的鼻咽癌发病风险预测综合模型联合现有的EB病毒抗 体筛查，将PPV由原先的4.7%提高至43.2% ,解决了现有筛查方法 效能低而无法在人群大规模应用的瓶颈。睾丸生殖细胞肿瘤筛查常用的血清蛋白标志物AFP、人绒毛膜促性腺 激素和乳酸脱氢酶诊断效能不理想，仅在26%47%的患者中出现升 高，且特异度有限。多项研究说明，基于miRNA的生物标志物，特 别是miR-371a-3p ,检测效能明显优于传统血清蛋白标志物，诊断灵 敏度、特异度和PPV均大于90%。另一项研究同样说明血浆miR371 表达对于预测活动性生殖细胞恶性肿瘤具有高特异度和高PPV

21、(100% ),检测效能(AUC=0.97 )优于血清蛋白标志物 (AUC = 0.630.75 )和CT ( AUC = 0.77 ) o因止匕，未来可考虑建立 miRNA技术的国际化标准并引入6/R3ZZ作为生殖细胞肿瘤筛查的分 子标志物。颅内肿瘤确实诊主要依赖于侵入性手术获得的组织标本，非侵入性的 诊断方式可防止不必要的手术风险和患者焦虑。Nassiri等证实了血浆 DNA甲基化信号可以很好地区分脑胶质瘤和其他颅内肿瘤以及健康 受试者(AUC = 0.99 );同时，甲基化分类器在突变型和野生型 脑胶质瘤、低级别以及高级别脑胶质瘤中均展现了出色的诊断效能 (AUC0.98 )。由此可见，

22、液体活检技术或可作为颅内肿瘤标准诊 疗流程的补充，辅助诊断可能不需要手术干预或手术风险大于获益的 人群，以减少侵入性诊断操作带来的损伤风险。另外，对于需要手术 的肿瘤，术前辅助诊断的信息可帮助优化手术方案及平安性。总之，液体活检的开展与探索将填补此类恶性程度高且目前没有推荐 筛查方式癌症的空白，未来更多大规模前瞻性研究有望提高这类癌症 的早期筛查效能，进一步改善患者预后、提高生存率。三、液体活检在多癌种筛查的进展NCCN指南推荐的筛查方式主要针对单癌种，且大局部癌种没有推荐 的筛查方式，而多癌种筛查更符合民众需求。以吸烟为例，一位60岁 有吸烟史的女性做四种癌症筛查（LDCT、肠镜、乳腺铝靶、

23、宫颈液基 细胞学涂片）的累计假阳性率可高达43% ,因此，同时做几个风险因 素相关的单癌种筛查不但会造成较高的累计假阳性率，并且屡次筛查 也会加重经济负担。止匕外，现阶段早筛技术亟需在高度准确敏感的检 测和大规模筛查之间取得平衡，相较于单癌种早筛技术，多癌种筛查 技术可以同时检测多种癌症，并提供准确的组织溯源结果，以限制评 估无病症患者的范围、本钱和复杂性，被认为是下一代癌症早筛技术 的突破口，受到科学界和产业界的广泛关注。多癌种研究的技术壁垒更高，理想的多癌种筛查技术需要同时满足以 下几个条件：（1 ）高特异度，防止过度诊断和过度治疗，减少受检者 作为体外诊断的重要分支，液体活检还具有快速便

24、捷且侵入性小等优 点。随着液体活检技术的开展，癌症的早筛、早诊也产生了诸多突破 性进展。本文主要就液体活检在癌症早筛、早诊技术的开展现状加以 综述，并对未来癌症诊疗新格局进行展望。一、现有癌症早筛手段的局限性尽管早筛、早诊可以显著提高早期癌症检出率，降低癌症相关死亡率； 但受限于当前检测技术等诸多因素，目前大局部癌症没有推荐的筛查 方法。美国癌症研究所只推荐对肺癌、结直肠癌、乳腺癌和宫颈癌进 行筛查，获得推荐的筛查手段也只能做单一癌种筛查，灵敏度和特异 度也不够理想。而且由于局部筛查方式存在侵入性、操作不便、有辐 射性等问题，导致民众对于筛查的依从性很低。LDCT是肺癌常规筛查手段，美国肺癌筛

25、查工程数据显示，LDCT筛查工/口期肺癌的检出率约70% ,但同时也带来了较高的假阳性率。肠镜 检查是结直肠癌诊断的金标准，肠镜筛查可以降低56%的结直肠癌发 病风险以及57%的死亡风险；但由于肠镜操作复杂（需要良好的肠道 准备、完整的盲肠插镜率和足够的退镜时间），以及存在穿孔、出血 等无法忽视的并发症，导致临床依从性很低。中国医学科学院肿瘤医 院2019年发起的一项研究显示，在结直肠癌高风险人群中，仅有约 14%人群同意接受肠镜检查。乳腺铝靶（X线）筛查乳腺癌在特异度 不必要的精神焦虑和随访负担；（2 ）高灵敏度，降低漏检率，减少进 展至晚期的患者人数；（3 ）组织溯源准确性，准确告知肿瘤发

26、生的具 体器官，精准指导后续的临床检查方案；（4）高性价比，使筛查的成 本可以控制，便于大范围推广使用；（5）侵入性小，便于操作，从而 能够提高民众筛查的依从性，易于推广。液体活检作为体外诊断的一 个重要手段，具有快速便捷、侵入性小等优点，为多癌种筛查提供了 极具潜力的途径。肿瘤细胞通过坏死、凋亡、分泌等形式，向外周血释放cfDNA、miRNA、 外泌体、CTC等信号，随着测序技术的开展，借助高灵敏度的高通量 测序等技术，可以对血液中的这些肿瘤信号进行捕捉、检测。而机器 学习技术的引入,进一步提高了肿瘤信号检测的灵敏度。目前国内外多家研究机构正在开展基于血液液体活检检测技术的多癌 种筛查的研究

27、。Liu等开展了一项前瞻性、多中心、病例对照、观察性 的纵向随访研究，循环游离基因组图谱（circulating cell-free genome atlas , CCGA ）,旨在开发并验证通过一管血实现多种癌症 的早期检测（multi-cancer early detection , MCED ）和组织溯源， CCGA在北美142个医疗中心共招募了 15 254例受试者（8 584例 癌症受试者，6 670例非癌症受试者），分为三个子研究CCGA-1.CCGA-2和CCGA-3O其中CCGA-1为原理发现阶段，纳入分析训练 集样本1 785例，验证集样本1 015例，同时对三种不同的基因组

28、测序方法进行了全面比拟，结果显示全基因组重亚硫酸氢盐测序（whole genome bisulfite sequencing , WGBS ）检测 cfDNA 甲基化模式的 性能，分别优于全基因组测序检测拷贝数变异和靶向测序检测单核苜 酸变异/插入/缺失；在组织溯源上，甲基化优于另外两种方法学。最 终确定了基于cfDNA甲基化的多癌种筛查技术路线。CCGA-2为试剂 研发和机器学习模型构建、初步验证阶段，纳入分析训练集样本3 133 例，验证集样本1 354例，利用WGBS对血浆cfDNA进行分析，靶 向位点组合涵盖了超过10万个信号丰富的甲基化区域。通过机器学习 建立了多癌种筛查模型并进行初

29、步验证，可以同时检测50种癌症， 整体特异度为99.3% ,灵敏度为54.9%，组织溯源准确性为93%。 CCGA-3为大规模的临床验证阶段，共纳入分析4 077个样本，其中 癌症患者2 823例，非癌症人群1 254例，主要目的是对模型进一步 优化后在一个独立的验证集中进行验证，结果发现在超过50种癌症类 型中检测到癌症信号的特异度为99.5%，总体灵敏度为51.5% ,且灵 敏度随分期升高（IIV期灵敏度分别为16.8%、40.4%. 77.0%和 90.1% ）0组织溯源预测真阳性的总体准确率为88.7%。在12种预先 指定的癌症（约占美国每年癌症死亡人数的2/3 ）中Im期的灵敏度 为

30、67.6% ;在肿瘤高危人群5079岁的受试者中，研究团队预测了该 模型的PPV和NPV分别为44.4%和99.4%0这些结果支持了这种以 血液为基础的MCED筛查作为现有单癌种筛查的补充的可能性，对整 个行业具有重要参考意义，但CCGA系列研究也具有一定的局限性： 如果在癌症患者进行活检后采集血液样本，与活检前相比，可能会增加血液中cfDNA的比例；另外CCGA是一项病例对照研究，可能不 能完全反映该试验在人群筛查条件下的表现。在后续进行的前瞻干预 性研究PATHFINDER中，为了评估该模型的效能，招募了来自美国7 家临床机构的6 662例2 50岁的受试者,并根据是否有吸烟史、肿瘤 史、

31、肿瘤家族史区分为高风险和一般风险组，进行MCED筛查，研究 中期结果显示，该模型的PPV为44.6% ,其中高风险组和一般风险组 分别为57.1%和30.0% ,模型预测首发或次发组织来源的准确性为 96.3% ,中位观测时间到确诊为50 d0 PATHFINDER参与者的随访将继续进行，并将确定所有参与者在首次抽血后12个月内的癌症诊断发 生率，届时将评估MCED测试的特异度和NPVO与CCGA的发现一 致，在PATHFINDER的中期分析中，MCED测试可以在广泛的癌症 类型中检测到癌症信号，且具有较高的平安性，这些结果支持了 MCED在临床实施的可行性。CCGA系列研究主要基于cfDNA

32、甲基化检测，其他技术类型以及基于液体活检的多组学研究也在纷纷开展。液体活检的多组学研究也在纷纷开展。Cristiano等基于cfDNA全基因组片段化谱，开发了一个人工智能平台DELFI ,用以评估整个基因 组中cfDNA的片段化模式，研究纳入6种癌症类型（乳腺癌、结直肠 癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和胆管癌），结果发现该模型识别癌症患者 的灵敏度为82%，特异度为98%，组织溯源准确性为61% ;止匕外， 研究者将DELFI联合cfDNA突变做了进一步探索，在特异度98%的 情况下，灵敏度提高到91%0除此之外，Cohen等开发了名为CancerSEEK的血液测试,研究纳入1 817例受试者（1 0

33、05例IIH 期癌症患者；812例健康对照），将cfDNA突变检测与血清蛋白生物 标志物结合起来，检测8种癌症（卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食 管癌、结直肠癌、肺癌和乳腺癌）的整体特异度99%,整体灵敏度为 70% , I期灵敏度为43% ,组织溯源的准确性为63% ;鉴于驱动基因 突变通常不是组织特异的，绝大多数组织来源的信息来自血清蛋白标 志物。该团队还曾开展过一项研究DETECT-A ,这是全球首个万人泛 癌早筛干预性前瞻性临床试验，研究对象为10 006例未发现癌症的女 性，年龄6575岁，评估基线检测cfDNA突变（16个基因）与蛋白 标志物（9个）联合PET-CT成像检测用于癌症筛

34、查的平安性和可行性； 结果显示随访12个月，总计发现96例癌症患者，血液检测联合含 PET-CT在内的影像学检查发现26例癌症患者，特异度为99.6% ,灵 敏度为27.1% , PPV为40.6% , NPV为99.3%0这一结果提示在无症 状人群中进行血液检测是可行的，可以作为常规癌症筛查手段的有效 补充。但与CCGA的甲基化泛癌检测效能相比，突变联合蛋白的检测 结果就稍逊一筹。考虑到不同种族间存在甲基化特征差异，在中国人群中，cfDNA的甲 基化检测能否应用于泛癌种的早期检出以及组织溯源的准确性还需要 进一步的临床研究验证。因此，在中国大规模群体中开展基于液体活 检多组学的前瞻性、多中心

35、的多癌种筛查研究意义重大。基于单链建 库技术的cfDNA甲基化检测技术平台ELSA-seq ,不仅可实现超低量DNA的稳定建库，并通过专利算法进行信息学多重降噪，通过机器学 习精准捕捉肿瘤信号，在同一组样本中，比代表液体活检最高灵敏度 的二代测序（next-generation sequencing , NGS ）和微滴式数字 PCR,灵敏度高出10倍以上。基于ELSA-seq甲基化检测平台，复旦 大学附属中山医院开展了一项针对6癌种早筛的病例对照研究 THUNDER ,评估了基于cfDNA甲基化测序技术在多癌种筛查中的应 用；该研究纳入1 108例受试者（625例癌症受试者和483例非癌症受

36、试者），检测了国内6种高发癌症（肺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌和结直肠癌）验证集模型的特异度为98.3%，灵敏度为80.6% ,组织溯源的准确性为82%O这项6癌种早筛研究，初步证实cfDNA甲基化检测在中国人群中作为泛癌种早筛的可行性（图4）。技术类别及趣癌肿模型效能循环肿fB* 外迩体-微小RM 宏白标名物 仍不髀DM癌症枪泅机学习、ffliRM*CCCA3灵敏度：51. M）,7. ceNA甲苗化序技木特B度：W.S%rKf 50粗税测源准性：88.0*1口 .CancerSEEKcfDNA突交量白及生瞥具度：7O 标志物雄测技术特异度：99%4巢礁、叶H口等、 位税冽源准确性：63

37、、*,站直JK癌、肺癌网乳腺再THUNDE8efDNA甲露化制序技术 灵敏度：8a 6% 卡罐.*#.特异度：98.3*货舱有、H龈/和；fl蛆快测源日性：82%DEIFIcfDNA片段枪费技术乳婶癌.卵累癌.W灵敏度：82依罪度：98蛆蜗测源准性：61、DETECT A艮敏度：27.1、必卜 cfDM突受十蛋白项特异度：99. 6.纪魁娘句阳W值”影像学椅谢技术阴性懵谢值：99.31见PATHF1XDER cfDNA甲基化费序技术阳性filH值：44.6M (kRita： 97.lt;VR 30.0) 组步测源准性:85.at；注:cfDNA 为细胞游离 DNA ; CCGA3、Cancer

38、SEEK. THUNDER、DELIFI x DETECT-A. PATHFINDER均为多癌种研究名称图4液体活检在多癌种筛查的进展、液体活检的局限性和开展展望随着各界对癌症早筛的关注逐渐升温，基于液体活检的癌症早筛相关 技术的开发也取得了一定程度上的突破，不但使得一管血进行癌症精 准早筛成为可能，而且使得一管血同时进行多癌种筛查成为可能。但 是，目前液体活检所面临的挑战也不容忽视：（1）灵敏度、特异度等 癌症早筛关键技术指标仍有待提升。ctDNA是坏死或凋亡的肿瘤细胞 释放到外周血中的肿瘤DNA片段，但是由于在癌症早期，肿瘤ctDNA 在血液中含量非常低，如何通过液体活检技术捕捉血液中含量

39、极低的 肿瘤信号成为技术开发的关键，针对本文提及的癌症早筛受到早期肿 瘤信号相对较低限制的问题，目前认为通过超高深度的测序可以提高 不同癌症类型检测的灵敏度，通过该方法检测限（limit of detection , LOD ）可低至0.001%。止匕外，通过选择测序ctDNA片段的大小和基 于单链建库也是提高ctDNA检测灵敏度的有效方法。（2 ）不同癌种 早筛产品的核心评估指标应有所侧重。灵敏度和特异度是评估癌症早 筛产品性能最重要的核心指标，灵敏度和特异度此消彼长，难以同时 满足较高的水平。同时，不同类型肿瘤血液中ctDNA的浓度也有所不 同，例如，肝癌、胆管癌、食管癌和卵巢癌释放入血的

40、ctDNA信号较 多，而前列腺癌和乳腺癌那么可能释放入血信号较少，这就导致针对不 同癌种的早筛技术的灵敏度也应该有所不同。因此，需要在开发癌症 早筛产品时同步考虑不同癌种的血液ctDNA浓度、惰性或侵袭程度和 后续临床诊断路径，从而对灵敏度和特异度这两个指标进行综合评估, 有所侧重，寻找最正确平衡点。例如对于后续有低伤害性临床确诊路径 的癌种，提升灵敏度更为重要，为此可以容忍低特异度,目的是尽量 减少漏诊；而对于后续没有成熟的临床确诊路径且相对惰性的癌种， 那么需要保证较高的特异度，为此可以容忍低灵敏度，目的是尽量减少 误诊。（3 ）泛癌种早筛模型需要灵活的针对泛癌种和单癌种的混合模 型。目前

41、，癌症早筛产品既包括针对特定潜在高危人群的单癌种早筛 产品，也包括针对一般风险人群的泛癌种早筛产品，但是泛癌种早筛 的应用场景实际上包括单癌种早筛的应用场景，这就需要在泛癌种模 型开发时同时兼顾适合泛癌种和单癌种的混合模型，从而满足那些拥 有遗传性肿瘤基因突变的人群或者有某种癌症家族史的人群想做单癌 种筛查的需求，也在一定程度上解决了短期内泛癌种产品只针对高端 消费人群的限制。（4 ）目前早筛产品的价格仍然较高，普通群众难以 承受。这在一定程度上压制了民众做癌症早筛的需求，限制了癌症早 筛在中国的普及。因此，如何控制本钱和促进医保的逐渐覆盖是降低 癌症早筛单次检测价格的重要因素，也是未来亟待解

42、决的问题，随着 技术的开展，测序本钱的降低，预计在不久的未来，早筛产品价格将 显著减低，使广大民众能够接受。（5 ）普通人群以及临床医生对癌症 早筛的必要性以及目前癌症早筛产品都了解缺乏，这极大限制了癌症 早筛产品的市场推广。有必要借助各媒体渠道，通过宣传更多肿瘤早 筛的成功案例来提高民众对肿瘤早筛的认知和了解，从而提高民众做 癌症早筛的意识和接受度；另外还需通过学术会议推广等形式推动将 肿瘤早筛产品纳入指南等途径来提高临床医生对肿瘤早筛产品的认可 度。但是长期来看，随着基于基因组、转录组、表观遗传组、蛋白组等多 组学的“下一代联合型液体活检技术的成熟，cfDNA甲基化联合 ctDNA突变、m

43、iRNA表达和血清肿瘤标志物或可使灵敏度和特异度 等癌症早筛关键技术性能指标得到极大提高，从而降低漏诊和误诊的 概率；由于不同组织具有独特的DNA甲基化模式，器官特异性强，因 此基于甲基化可以进行癌症的组织溯源，进而为下一步的针对性的临 床检查指明方向。同时，随着测序本钱的不断下降和医保的逐渐覆盖， 有望降低癌症早筛的单次检测价格；止匕外，通过政府、企业、媒体等 多方持续的市场教育，癌症早筛理念在普通群众中会逐渐得到广泛普 及。相信不久的将来，癌症早筛技术将会改变中国肿瘤诊疗的格局，癌症 早筛特别是泛癌种早筛可以帮助医院和医生在早期发现更多的患者； 基于泛癌种早筛的结果，患者可以被精确导流至各

44、个首诊科室进行下 一步精确检查，同时还可以接受多学科团队的协同诊疗。在诊疗过程 中，还可以通过NGS伴随诊断对患者进行精准治疗、精准复发监测， 或精准靶向到新药的临床研究中，使患者接受全面而先进的诊疗,以 获得最大的生存质量。在这个新的格局下，医院或者医联体机构成功 打造了患者诊疗全流程的闭环，使各个学科充分整合，极大改善肿瘤 患者的预后。在这个闭环中，泛癌种早期筛查是源头和突破口，对促 进我国癌症的早诊早治、提高患者生存率、降低死亡率，减轻社会负 担等，都具有重要的临床意义和社会价值。96%时,灵敏度可到达80%。乳腺铝靶联合乳腺超声筛查可到达96.2% 的灵敏度和92.6%的特异度。我国乳

45、腺癌易感人群接受X线筛查的比 例约为50% ,而在欧盟国家，筛查率约为95% ,显著高于我国。中国 乳腺癌筛查指南推荐的乳腺B超筛查，我国3569岁女性的筛查率仅 为22.5%0止匕外，每年接受乳腺X线筛查可能存在诱发恶性肿瘤的风 险，据估计，一生中乳腺X线辐射诱发恶性肿瘤导致的女性死亡率为 16/10万。宫颈液基细胞学涂片筛查宫颈癌的性能优于巴氏涂片，但 灵敏度依然较低，在特异度96.3%时，灵敏度仅为53.0%。相比单癌种特殊的筛查手段,血清肿瘤标志物筛查是另一种广泛用于 单癌种或多癌种筛查的手段。有文献报道癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ,CEA 在结肠癌中的

46、灵敏度为 40.5% , 特异度为95.4% ;在胃癌中的灵敏度为19.8% ,特异度为95%0但 CEA在肺癌、乳腺癌等肿瘤以及一些良性疾病中也有高表达。糖类抗 原 19.9 ( carbohydrate antigen 19.9 , CA19.9 )在中国胃癌人群中 灵敏度为10.3% ,特异度为95% ;在胰腺癌中灵敏度为64% ,特异度 为99%其他如肝、肺部以及妇科等良性疾病中也可见CA19.9升高。 综上可见,血清肿瘤标志物灵敏度及特异度均不高，常常在肿瘤进展 到一定阶段才发生指标升高，且在局部良性病变中也同样会发现相似 的变化，通过血清肿瘤标志物的单独升高无法提示肿瘤来源，因此无

47、 法作为临床常规筛查手段推广(图1)。呦心血清肿瘤部位标志物Pro-SFTPBCYFRA21-1肺 A CEACA125CEACA15.3AFP肝AFP-UPIVKA 川CA125HE4卵巢CA72.4CA15.3f INMP22膀胱75 BTA灵敏度 (%)11222122273816253737603777816756316964特异度厂 1 n部位胆囊胃J KF血清肿瘤 标志物一CA199CEACEACA19.9CA724CA19.9CA125CEACA199PSAAFP即HCGLDH灵敏度乞 6)。5079201029643241361001418353728特异庾 (%)937995

48、95959998959391:9092829595 、95957777/41iJrJ.L.腆腺Dfc/结直肠fp V-前列朦f_41一 察丸66灵敏度(%)注：Pro-SFTPB为前外表活性蛋白B ; CYFRA21-1为细胞角蛋白19可溶性片段；CEA为癌胚抗原；CA为糖类抗原；AFP为甲胎蛋白； APF-L3为甲胎蛋白异质体3 ; PIVKA-口为异常凝血酶原；HE4为人 附睾蛋白4 ;NMP22为尿核基质蛋白22 ;BTA为膀胱肿瘤相关抗原； PSA为前列腺特异抗原；0-HCG为人绒毛膜促性腺激素；LDH为乳 酸脱氢酶图1不同人体部位血清肿瘤标志物的灵敏度和特异度总之，现有的癌症筛查手段

49、比拟匮乏，依赖于软件及硬件的支持，对 广大基层医疗卫生机构的医疗资源和技术水平要求较高，民众接受度 较低，花费较大，收益较小。基于以上国情，研发和推广具有更高效 率、更高性能以及更经济的肿瘤早期筛查技术对我国的肿瘤防治工作 具有重要意义。二、液体活检在不同癌种中的筛查进展近年来涌现出许多癌症早筛、早诊的方法，可以提前检出或者帮助鉴 别诊断良恶性肿瘤。液体活检作为体外诊断的重要分支，具有快速便 捷且侵入性小等优点。常见的生物标志物包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell ,CTC )、循环肿瘤 DNA( circulating tumor DNA , ctDNA )、细胞游

50、离 DNA ( cell-free DNA , cfDNA )、夕卜泌 体和循环肿瘤RNA等。ctDNA是基于对肿瘤相关驱动基因变异的检 测，因而利用其进行肿瘤筛查可能具有较好的特异度；但由于早期肿 瘤患者突变负荷低，目前的检测技术难以检测到浓度极低的ctDNA含 量，因此ctDNA的检测多用于局部晚期或远处转移的肿瘤。ctDNA某些区域的异常甲基化也可作为早期筛查的生物标志物。基因启动子 区域的甲基化改变在癌症发生的早期阶段就会出现，甚至早于基因突 变出现之前。在早期癌症中，相关的特异性甲基化位点众多，其改变有数量级上的优势。除了 DNA，外周血中包含多种RNA ,其中微小RNA ( mic

51、roRNA , miRNA )在细胞生长、发育及疾病开展中起着d分重要的作用，血清中miRNA在肿瘤中会呈现特异表达，但是单个miRNA作为生物标志物的预测效能缺乏,因此基于循环miRNA和外 泌体miRNA进行多个标志物的建模以及标准化miRNA的别离和定量和用于数据分析的方法是目前探索的主要方向（图2）。下文将主要 就液体活检在常见恶性肿瘤早期筛查取得的重要突破研究分别进行阐 述（图3）。注：cfDNA为细胞游离DNA图2液体活检与常规检查在肿瘤筛查的区别 注：cfDNA为细胞游离DNA ; AUC为曲线下面积；EBV DNA为EB 病毒DNA ; PPV为阳性预测值；NPV为阴性预测值；

52、ctDNA为循环 肿瘤DNA ; miRNA为微小RNA ;图中斜体代表各类生物标志物名称 图3液体活检在单癌种筛查的进展 cfDNA甲基化：夹受/野生AUC 0.99EBV DNA：灵敏度97. 1%,特异度98. 6%, PPV11.0%. NPV 100.0% ctDNA突变：灵敏度74. 2%,特异度92.0% cfDNA甲基化：AUC 0.81 iR-92a联合iR-133a： AUC 0.91食管 cfDNA甲基化：灵敏度74. %,特异度95. 9%ctDNA突变：IID期灵敏度41.0%67.0%, 特异度98.0%cfDNA甲基化：IAHI期灵敏度51. 681. 4%, 特

53、异度95. 8%cfDNA片段图谱：灵敏度90.0%,特异度80.0%6个肿痛自身抗体组合：III期灵敏度92. 2%, 特异度85. 7%, PPV 59. 4%, NPV 97.5%7个miRNA组合：灵敏度83.2,特异度93. 9% cfDNA甲基化：灵敏度83. 6%,特异度96.0%10个甲基化标志物蛆合：灵敏度83. 3%,特异度90.5%5羟甲基胞噎喔/末端序列/片段分布/核小体印 迹：灵敏度95.4乐 特异度98.0%SEPT9甲基化位点：灵敏度48. 2%,特异度91. 5% cgl0673s33甲基化位点：具敏度89. 7%,特异度86.8%多犯点甲基化；灵敏度83. 6

54、%87.特异度83. 391. 9%290：灵敏度70. 1、，特异度91. 2%cfDNA片段图谱：灵敏度97. 4、，特异度94. 8%2个甲基化标志物（尿液）：灵敏度90.0%，特异度83. 1、4个说!?独组合：灵敏度82.0X,特异度91.0%8个miRNAtS合：AUC 0. 923个甲基化标志物组合：灵敏度57.9%,特异度88. 1% cfDNA 5-羟甲基胞啜唳：AUC 0.920.94多个uiRNAlfl合：灵敏度85.0,特异度64. 3%85. 4%5个外泌体蛋白蛆合：灵敏度86.4%,特异度81.0% 12个111独组合：灵敏度87.0,特异度68. 4乐PPV6. 6%, NPV 99. 5%产.cfDNA甲基化，而液AUC 0.99.尿液AUC 0. 86外泌体（尿液）.灵敏度91. 9%,特异度34.0事丸iR-371a-3p：灵敏度90.1乐 特异度94.0(一)肺癌cfDNA可以在突变、甲基化和片段化三个层面为肺癌早期筛查提供信 息。有研究说明利用cfDNA突变特征区