免疫印迹技术

1、蛋白样本制备与免疫印迹(Immunoblottingtechnique)郭南京中医药丸学军教授生物化学与分子生杨学糸基本概A念印迹法fblottingj是指将样转移到固相栽体上，而后利用相应的採测反应来检测样的一种方出。1975年Southern立了将DNA转移到硝酸纤维素膜CNC膜丿上，并利用DNA-RNA杂夾检测特走的DNA片段的方廉p称为Southern印迹法。而后人们用类做的方法，对RNA和妥匂质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹岀，对单向削冰后的妥匂质分子的印迹分析称为Western印迹法，对巩冰后妥仓质分子的印迹分析称为Eastern印迹法亠WesternBl

2、ot基本原理一种将凝胶电冰与固相免疫结合起来的分子生杨学技术。在勒场的作用下将亀冰分雳的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Submte敝曲IEProdiid*其基本过程主要有2ProteinBlotonNitrocellulose三个工序：1、将蛋自质经换胶削冰按分子量夬小不同依次分爲；I丄2,将分雳的组分转FLabelwithSpecificAntibody印到印迹膜上；3,对转印到印迹膜上的蛋勺成分进行免疫学检测。SDSPolyacrylamideElectrophoresis丄物秀www.bRevealsProteinofInterest蛋白样品的制备蛋白含

3、量测定蛋白质变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜免疫学检测WesternBlot般流程封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,曝光、显養定影r蛋白样本制备成功蛋白分析的基础1、制备蛋白样本的目的体外活性测定(invitroassay)免疫印迹杂交(Immunoblot)免疫沉淀或共沉淀(Immunoprecipitation)A电泳迁移率变动分析(EMSA)双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis)染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipit2、蛋白质的性质、分类与分布细胞.组织、微生物.酵母A亚细胞定位：胞浆、胞膜.胞核、细胞器A性质：水溶、脂溶A其他

4、：含量多少、分子量大小、磷酸化等3、方法的选择Nude*pcre1拔孔Nucleolus校仁NuclearmembraneA自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取A购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取SmootheMoplasmioreticulum光面內质网Mitochondrionft壮体RougheMophsmfereticulumCtl)mmbrantCySpMm细胞质校腮-NucUusGoJji枷尔加体Centriole心体二细胞中总蛋白的制备1、组织或细胞破碎机械匀浆组织分散机、玻璃.超声破碎反复冻融干冰反复于零下1520C使之冻固，然后缓慢地融解,反复操作低渗溶液去污裂解液表

5、面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化节烷基二甲基镀等）媒耳刿卜子型（TdtonX-100、TirtonX-114.吐温60及乎温80）旱。2、细胞裂解液其它：H20NaCk还原剂缓冲液表面活性剂蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂*2.1缓冲液稳定pH环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性。有Tris-HCI,HEPES(H+),MOPS等体系(pH7.5)2.2表面活性剂溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为1阴离子型：SDS,脱氧胆酸盐2阳离子型：CPB和CTAB3双性离子型：CHAPS和Zwittergent系列4非离子型：Brij系列、Triton-

6、100NonidetP40Tween2.3蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入庇帥細1糾軸絲FMSFAPMSF申翹白齣紺Upi血in翔htEanddine般生助屣峨白厭血丽鞘紙股血赢躺，瓯触卿庭就CDTT輔基宓mmEDUEG1A冒禹側抑删（p耶ta血）ProteaseInhibitorCocktailSetIandProteaseInhibitorCocktailSetI,Animal-FreeInhibitorM.W.IXConcentrationTargetproteaseAFBSF.Hydrochloride239.5500pMSerineProteas

7、esAprotinin,BovineLungorAprotinin,RecombinantAnimal-Frcc)6512150nMSerineProteasesandEsterasesE-64ProleabeInhibitor357.41nMCysitciricProteasesEDIA,Disodium372.2500uMMctalloprote-asesLeupeptin,Hemi-475.G1uMCys-teineMilfairProteasesandTrypsin-likeProteasesProteaseInhibitorCocktailSetIIInhibitorM.W.Conc

8、entrationinthevialTargetproteaseAEBSI;Hydrochloride239.520niMScrinrProtrarBestatin308.41.7mMAminopeptidaseBandLeucineAniinopeptidaseE-64ProteaseInhibitor357.4200pMCysteineProteasesED1A.Disodium372.285mMMctalloprotc-ases2.4磷酸酶抑制剂选择抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化,使用前临时加入磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸

9、磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）o试剂名称常规的抑制剂主要包括:抑制作用氟化钠正帆酸钠焦磷酸钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶丝氨酸苏氨酸磷酸2.5还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、卩一蔬基乙醇等。2.6其它水；溶剂；NaClo超纯木的勒阻率就是单佞厘采内的水的削阻值。即18.25MQ*CM.2.7全蛋白抽提时注意事项注意事项细胞或组织的样本量抑制蛋白酶及磷酸酶Temperature试剂和器皿冰上预冷，低温4C操作可以适量加入甘油，稳定蛋白裂解液的用量可以适量加入Benzonase/DNaseI等核酸酶，去除D

10、NA,充分提取蛋白，降低提取的粘度.2.8细胞裂解液RIPABuffer的配方分析及技术要点RIPA组成终浓度作用作用匱理技术要点可选Tns-HCl(pH7.5)50itlM缓冲腋提供PH环境使蛋白保持稳定，增加溶解性卫1远离FI时蛋白质洛解度增高，避免极端PHTns休系受温度彫响很大，调在工作温度时的FH缓冲液种类:以覆羞所需PH有效缓冲范圉为好Hepes-KOH等NaCl150mM调节离子强度高蔑子强度导致蛋白聚集和沉淀，一股在低渗条件下提取K等EDTAInM金属离子螯和剂金属蛋白酶抑制剂去除金属离子（戈Mg等,否则提取物粘MSS不易溶解.抑制某些金属蛋白醯的话性，防止蛋白质降解.EGTA

11、NonidetP-401.0%表面话性剂（去污剂）非离子型溶解与稳定蛋白去網别是膜蛋白TritonX-100IgepalCA-630等产品选择指南sodiumdeoycholate0.5%阳离子型同上CPB和CTAB脱氧胆酸盐SDS0.1%阴离子型同上Sarksy1（十二烷基加氨酸钠）变性剂破坏蛋白质的次级犍，使二级及三级枸象解体，但不破坏共价键（ft键和二硫臆），不改变一级结构溶解型:SDS盐酸呱尿秦況淀型:TCA氮仿异戊醇SodiumFluorideScdiumPyrophosphateNa3VO450irM5mHQ5mH磷鑽抑制剂抑制磷酸酶活性，防止蛋白样本脱磷酸化活化、复配、使用前临叶

12、加入产品选择指南AprctininPepstatinLeupeptinPMSFlmicrog/mllmicrog/mllmierog/ml0.ImMProteaseInhibitor蛋白酶抑制剂抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、丝氨酸蚤白酶类、组织蛋白酶类等蚤白酶的活性，防止蛋白样本被水解复配、使用前临时加入ProteaseInhibit。鸡屋酒产品选拉指南DTT1mM还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键，新鮮使用，防止氧化疏基乙醇和二硫苏糖醇DTTh2o三蛋白样本制备产品选择产品实脸材料提恥原理产物应用为容简介分折其它细胞个/Tml组织巾g/Tm11DPAG2DPAGWesceBlocActiVHyA

13、ssay全蛋白5x101DD-3DD温和去污剂裂解细胞1得天然活十生总蛋白/?ELTSA细胞裂解液蛋白酶抑制剂魏酸酶抑制剂及核酸酶檢蛋白102DD-3DD先分别提职蛋白和胞扌亥，然点裂解胞核回收可涿的核蛋白，利用核戯酹消祀沉淀得到不溶的核蛋白2-3饴胞浆蛋白可溶檢蛋白不溶核蛋白EMSA细胞裂解液配有蛋白酶抑制剂核酸酶膜蛋白5x102DD-3DD械碎细胞去除可溶胞浆蛋白眉，再利用溶解沆淀申的腿蚕白细胞內各类膜蛋白蛋白翻译七修饰、SELDTs芯片检测ELTSA.配有蛋白酶抑制剂亚细胞定位蛋白1-2x105DD按照蛋白亚细胞定住的不同策略逐级溶解。细胞质、细胞膜、细胞核与细胞育架蛋白4个纽分。蛋白定

14、位芯片检测ELTSA配有蛋白酶抑制捌磷酸酶抑制捌及垓酸酶过滤牲可溶/不可溶蛋白10-xW2DD-3DD按蛋白质溶解度不同分部抽提四个不同溶解度纽（分ELTSA提高低丰度蛋白分辨率嵇酸化蛋白10-xlD2DD-3DD利用RT展分离提职磷酸化蛋白1个磷酸化蛋白磷酸酶抑制剂线粒体蛋白5X102DD-3DD破碎细胞怎先誇心分藹出纯线粒体，并进一步将其蛋白溶解出来2份,线粒体蛋白和胞荥蛋白凋亡及借号转导相关的靶蛋白细胞内移位研究福尔马林固定红L织7Dona5-I5Vid10-3Dmg试剂解开福尔马林固定过程中产生的化学1份全长可溶性蛋白不含去污剂染色及非染色的纽织、核蛋白样本制备可溶性核蛋白俎蛋白和DH

15、A结合蛋白核蛋白提取上淸沉淀V细胞核加裂解液2!O胞浆蛋白.上清沉淀VV加核酸菌抽提原理低渗裂解细胞膜，释放出胞浆蛋白与胞核；A离心分离出胞核;A高渗破裂胞核，释放出可溶性核蛋白;A加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白（组蛋白和转录因子）实验注意事项A试剂和器皿冰上预冷A裂解液的用量A细胞总量冷A抑制蛋白酶：蛋白訥制剂2、膜蛋白样本制备AqueoussolutionNonionicdetergentDetergent-solubilizedwprotein/3、亚细胞分级抽提:用超离心技术分离出细胞2mlwashbufferA?bttrp(lX|H1mlextractionbufferI却

16、”g畑IiwtQief3rtnit4*Cur4eXO*求*翊幻upfrratanih9e器、质膜和细胞核等成分,再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进CytosolicproteinextractFraction11mlextractionbufferII5|lirht4C(rAtolrvjntlxXb211CIA1&为*)luiM)nlc*wh*xfs10(TinA9XO-KO7M4zrwjiir5Wruuiiif加如mteiWMembrane/organelkproteinextradFraction2500plextractionbuff

17、erINSMliiibfCXftJUal11pllr3?5UEcfiiui/ieNickezeirwMMifeGroMpTcgHcxjirtbwIwihHigflOeX$S)Cxgr-1行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。NucleicproteinextractFraction3500(11exVactionbufferIVCytoskdetalproteinsFraction4IS-rtitKrMtMvascfrtutaUxvm1vf*x*Sbi,)O劝”/fWlbrw?BCA(bicinchoninicacid)是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种

18、类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cf与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS,TritonX-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂(EDTA,EGTA)、还原剂(DTT,疏基乙醇)和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradfoid法测定蛋白浓度。彳匕2、Bradford法蛋白定量考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶

19、液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。原理：染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰磯的测定。3、Lowery法蛋白定量Lowr

20、y法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法。原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷隹1酸盐一鹄酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钮兰和$乌兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。DCProteinAssayHill这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。免疫印迹(WesternBlot)白变bDS聚丙:酰胺弓转膜封闭一抗孵育二抗孵育显影五、蛋自质变性加一僖体积的上样缓冲液95C左右加热5jOmin2xSDS电冰上样

21、缓冲液:1MTris-base(pH6.8)2.5ml,p-5%)PH二8.8堆积作用:凝胶浓度较小，孔径较大,4.002.00浓缩胶4%TrispH6.8负极（低电导区，高电场强度）慢GLy-(pl=5.97)中间Pr_（pl大多接近5）快ci-正极pH=6.8Acr+Bish2oSDSTEMED10%AP用前加总体积4.007.840.08lOp120016mlK1.064.840.088ml浓缩效应在浓缩胶(pH=6.8)中HC1几乎全部解离为C1-,但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-OA蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HC1和甘氨酸之间。当电泳系统通电后

22、，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-,故C1-称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使聲质豊缩扩百倍。RvadyGvlMgraionCliarU(ProteininkD)nxciSDS聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围Separa

23、tionranffesofproteinsindanaturtHgSDSTrt%yxrUCet4jWcRnngco!9rtpnnitgnojimtmns*Sydflbuffer*Moinrrartioofriciiimtde：bi9ncr)nmB原则上每次上样前将蛋白重新煮沸变性。075mm厚的SDS的10孔梳每孔最多可上蛋白体积为20ul,15孔梳每孔最多可上蛋白体积为lOul。一般的蛋白每孔上样总量为20ug比较适宜，特殊蛋白特殊对待，075mm厚度的胶，每泳道最高承受能力为100ugoA为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体积不同时，最好用IX的上样缓冲液补平。A看漠酚蓝压缩成一

24、条线后把电压调为100V。当漠酚蓝跑至离胶的下面还有0.406mm时停止电泳*耳A只要被检测蛋白量占总蛋白的1/疔,即可被检测*9、姜匂markerkDa605040祁20MagicMarkXP-710-20%SDS*12010080kDa-175NuPAGE*Bis-TrisGel/NitiocelluloseineHibraiie.delectedwithWesieniBiceze*Clieinilumlneso?mKu一龙-33-25220NEB養自markerBio-rad彩虹marker在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦

25、联，电泳时迁移特性可能会发生某些变化，导致一些偏差，不太适合精确定位蛋白。10.联上蚤命质的检测（染色丿考马斯亮蓝染色染最小检出量为0.1ug最小检出量0.1-1ng*七、转濮蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后,蛋白质由负极向正极转移至膜上。1、半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加A轉印三明治Fitter尸apo；Nitrocellulose-在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030mino2、湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸堺，浸泡在转移装置的缓冲液中，电鼎片45min或过夜。聚丙坪I胺腔膜三明治半干转快速，约10-30min湿转较稳定，250mA91.5-2hjCjTjTT

26、TTTTiTTT()TTTTTTTTT)CTJI海绵PVDF凝胶3MM纸海绵垫白色筛孔扳最大凝胶尺寸(WXL)缓冲液要求擬胶容量推荐电源体积3XLXH)3、半干转仪安全盖带有弹簧锁的员电扳装置滤纸凝胶56滤纸7比修的鼻翻平台固定于4定栓上电缆底座:技术指标】24x16cm200ml400ug/cm2125-200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材科质地干的NC膜易脆软而厳机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿，避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速

27、免疫检测。适用范围0.45um一般蛋白0.2um分子量小于20kDS白0.lum分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸检测中）糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵6、转濮注盘事项恒流250mA,1.5h-2h,根据所需蛋白的分子量来调节。PVDF膜用前先在甲醇中浸泡15秒钟,然后在转膜液中浸泡15分钟以上后方可使用。“三明治”的制作需在转膜液中进行，确保各层精确对齐且不能留有气泡，胶靠负极（黑色），膜靠正极（白色）。半干转对胶、膜及滤纸的大小要求比较高，滤纸不能大于膜和胶而直接接触，这样会引起短路，湿转的要求不是很高。胶的左右方向要记牢，膜上做好

28、标记。为了防止过热因而导致在夹层中形成气泡或使凝胶变形，条带扭曲，转移过程应在冷室中进行。”转膜后检测丽春红染色可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照氨基黑染色不可逆，灵敏度为30ng/条带印度墨汁染色不可逆，灵敏度为6ng/条带胶体金染色灵敏度最高，400pg/条带免疫学检测1、洗膜TBST:Tris-base2.42g(pH7.6),NaCl8.0g,Tween-201ml,定容至1000ML2、封闭液脱脂奶粉（5%）BSA（3%）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）3、封闭注意事项封闭的作用是封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结合在膜上。可4度过夜或在常温l-3ho尼龙膜及

29、PVDF膜可适当延长封闭时间。奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白时，则不能用其作为封闭液。也可用3%BSA封闭。*4、免疫学反应抗体：单充隆抗体，多克墜抗体抗：种族特异性：H,R,M,来源:兔源，小亀源，鸣源Secondary/AntibodyPrimaryAntibody二抗：羊抗兔，兔抗小魚，驴抗兔Protein酶偶朕：AP、HRP5、多克隆抗体口抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。口抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机

30、体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Moncloneantibody)。口由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，口机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇,也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。6、单克隆抗体/抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。/当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和