荧光偏振常用荧光标记物

1、目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种。异硫氤酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结品粉末，易 溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体I型在效率、稳定性与蛋白质结 合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4,最大吸收光波长为490495nm, 最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可 保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感， 通常切片标本中的绿色荧光少于红色。480/535： 5-氨基荧光素 AF，EDF 和 HDF四乙基罗丹明(rhodamine, R

2、B200) RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性 质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm， 呈现橘红色荧光。四甲基异硫氤酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC 为罗丹明的衍生物， 呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm， 呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比 染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4

3、- 甲基伞酮-6 -D半乳糖苷受B -半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发 出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物 4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。5.镧系螯合物 某 些3价稀土镧系元素如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)等的螯合物可发射特征性的荧光， 而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分 辨荧光免疫测定。例系 镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3)、铽(Tb3)、铈(Ce3)等的螯 合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广Eu3螯合物的激发 光波长范围宽，发射光波长范围窄

4、，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫 测定。藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD 的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为 576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用58521nm的带通滤光片， 双激光器的流式细胞仪推荐使用57513nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约 为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，

5、 发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。碘化丙啶（propidium iodide， PI）可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用 RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长 激发下，PI的发射光谱为610-620nm。FL2探测器检测PI。中间体异硫氰酸荧光素乙二胺（fluoresceinthiocarbamylethylenediamine, EDF ）和异硫氰酸 荧光素己二胺（fluoresceinthiocarbamyl hexylenediamine , HDF ）合成：用甲醇配制1% 的

6、三 乙胺溶液，分别将20mg （0.3 mmol）乙二胺和34.8 mg （0.3 mmol）己二胺溶于5 ml甲醇三乙胺 溶液中；再将11.7 mg（0.03mmol）FITC溶于1 ml甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺和己二胺溶液中，室温避光搅拌反应1 h，浓缩，硅胶柱层析（乙酸乙酯：甲醇=3 ： 1，v ： v），得到 粉末状的EDF和HDF，电喷雾离子化质谱（ESI-MS）鉴定后，备用。名称吸收波长发射波长标记何基团FITC490495nm520530nm-nh2, -OH,-SH羟基荧光素（FAM）492518-nh , 2-oh,-sh四氯荧光素（丁E丁）521538-nh , 2

7、-oh,-sh六氯荧光素，Hexachloro fluorescein535556-nh , 2-oh,-sh四乙基罗丹明（RB 2 0 0）570nm595600nm-NH2四甲基异硫氤酸罗丹明（TRITC）550nm620nm-NH2羧基四甲基罗丹明（丁AMRA）560582-NH25-氨基荧光素（AF）二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶美、芘类等都可用于蛋白质标记。近年来，菁染料逐渐受到人们的关注。目前研究比较活跃的标记菁染料主要有两大类，一类是噻唑橙（thiaNOleorange, 丁O）、 橙 （oxazoleorang e,YO）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料孔。菁染料主要用于标记核 酸，高志宇等 9的研究表明，在喹啉环氮上引入适当的亲水性取代基，可以使丁。类的著 染