南京科捷液相色谱知识讲座

1、Acme HPLCHPLC Basic 目录 HPLC 根本理论 溶剂传输系统 (泵) 进样器 色谱柱 检测器 流动相什么是色谱图? 样品与流动相、固定相之间的吸收、分配、离子交换、体积排阻等作用，将混合组分别离成各个独立的组分。别离、定性、定量 ：分析色谱别离、纯化 ：制备色谱 Injection进样 Interaction相互作用 Elution洗脱 abacbc aabcbc a b c 色谱方法的开展历程部分片断洗脱溶剂(s)色谱柱样品Tswett (1906)色谱分析 气相色谱 液相色谱 - 流动相 : 气体 - 流动相: 液体 - 样品的挥发性 - 样品的溶解性 - M.W. 50

2、0 - 热稳定性 - 常温分析 - 离子化合物 -分离: 亲和力 及沸点不同 - 分离: 固定相和流动相的相互 亲和力不同HPLC 系统的配置流动相溶剂瓶泵进样器色谱柱检测器数据工作站梯度设备（脱气机）馏分收集器溶剂传输系统 (泵)泵 将溶剂流动相从溶剂瓶传送到进样器 泵 - 流速和压力的稳定性 - 操作方便, 可用于多种不同的溶剂 - 防止脉冲的系统 - 可用于等梯度模式和梯度模式 - 持久耐用 溶剂瓶过滤头高灵敏组件传感器高压过滤器泵 出口T型三通单向阀出口单向阀入口右泵头Inlet manifoldassembly溶剂 draw off assembly 左泵头单向阀出口单向阀入口机械马

3、达驱动流路图泵操作模式 等梯度模式 - 分析过程中，溶剂组分保持不变 梯度模式 - 分析过程中，按时间改变溶剂组分 - 单泵 : 低压梯度模式 - 并联泵 : 高压梯度模式等梯度模式-色谱柱泵检测器进样器溶剂瓶数据工作站 最根本的配置 在分析过程中，泵有效地传输组分不变的溶剂梯度模式按时间改变溶剂组分单泵 : 氦脱气和真空脱气低压模式溶剂 A溶剂 B泵混合器2) 并联泵泵 A泵 B高压模式溶剂 A溶剂 B混合器操作泵的注意点1. 必须对溶剂进行脱气 2. 勿空转3. 使用缓冲溶液之后一定要用水清洗 4. 检查溶剂间的可混合性5. 启动泵之前要灌泵6. 控制脉冲7. 检查泵压进样阀进样阀流动相中

4、加载样品，使流动相把样品带入色谱柱 进样阀 - Rheodyne 进样阀 (手动进样阀) - 自动进样器使用进样阀的注意点 1. 使用进样针前要清洗干净，并去除气泡 2. 清洗进样针 : 选择样品易于溶解的溶剂3. 附加清洗方法 : 使用过的溶剂 丙酮 二氯甲烷4. 使用自动进样器针管清洗溶液时要格外注意5. 连接管线越短越好 (进样阀和色谱柱, 色谱柱和检测器)6. 管线的错误连接会导致死体积的发生Rheodyne 进样阀1. 定量环进样阀 进样量由定量环体积决定2. 需要定期清洗定量环进样方式1. 全充满 - 进样量是固定时 - 进样体积 : 定量环体积的三倍以上 - 正确性 : 10m

5、常用于制备用途 大小硅胶形状不规那么形球形孔径大小 孔径大小 : nm or 选择孔径大小的方法 M.W. 推荐选用的孔径 10,000 300 1,000 分子量大 无孔形填料特性 孔径大小 & 分配 : - 孔径小 = 柱效高 = 减小谱带展宽现象 球形或不规那么形 : - 不规那么形= 外表积大 = 碳载量高 - 球形 = 柱压低 = 寿命长 - 球形= 很好的结构稳定性 = 寿命长 微粒大小 - 微粒小 = 所能承受的操作压力高 = 柱效高色谱柱 材料 - Steel 色谱柱 - PEEK 色谱柱 别离原理 - 正相色谱柱 - 反相色谱柱 - 离子交换色谱柱 - 体积排阻色谱柱色谱柱材

6、料 Steel 色谱柱 : 钢卡套柱 柱接头 PEEK色谱柱 Radial-Pak 色谱柱 别离方法 正相别离 反相别离 离子交换 体积排阻1. 正相 (吸附) 官能团的极性 使用疏水性、非极性的溶剂 极性大的化合物后流出Si-OH-OHSi-OHO正己烷极性正相色谱柱 Silica phase硅胶柱 - Resolve silica, u-Porasil, Nova-Pak silica - Hypersil silica, Nucleosil silica, Zorbax silica 键合固定相 - Nova-Pak CN, NH2 - u-Bondapak CN, NH2 - Reso

7、lve CN, NH2 - Hypersil CPS, APS - Lichrosorb CN, NH2, Diol - Zorbax CN, NH22. 反相别离 (分配原理) 键合固定相C18，C8，CN，ph与被分析物之间的分配作用，到达别离待测物的目的 使用极性溶剂 非极性的化合物后流出-Si-O-Si-C18 -OHCH3CN/H2O非极性反相色谱柱- u-Bondapak C18, CN, Phenyl- Resolve C8, C18, CN, Phenyl - Lichrosorb RP-18, RP-8- Delta-pak C18, C8- Symmetry C18, C8

8、 - Symmetryshield RP8- Hypersil ODS, Phenyl CPS- Zorbax ODS, C8, CN, Phenyl N, PhenylC18 色谱柱 Silica (SiO2)Acid Treatment(酸处理)Free Silanol (Si-OH)(硅羟基)Chemical Bonding of C18(键合)End-capping by TMS(封尾)Element Analysis封端技术-Si-O-Si-(CH3)3-Si-OHnon-polar-Si-O-Si-C18-Si-O-Si-C18TMS-Clnon-polar-Si-O-Si-C18

9、-Si-O-Si-C18正相和反相比照表样品出柱次序 溶剂（流动相） 极性 填料（固定相）极性 反相正相极性 非极性 非极性非极性（先） 极性极性（先）3. 离子交换 别离原理：各离子所具有的不同的电荷吸引力+-相反离子样品色谱柱填料阳离子色谱柱阴离子色谱柱SO3-NR3+COO-NH3+离子交换色谱柱 IC-pak Anion/Cation SAX(Strong Anion Exchanger)/SCX Protein-pak DEAE/SP HR4. 体积排阻 体积排阻色谱柱 GPC : Styragel HR, HT, HMW Series Aqueous GPC : Ultrahydr

10、ogel Series(凝胶渗透) Aqueous GFC : Protein-pak Series(凝胶过滤)色谱柱的选择正己烷YSilica, PorasilN甲醇 YCN, Ph, C8, C18 THF N GPC:Styragel HR, HT, HMWY离子性 NYNR3, COO, SO3M.W. 2000有机溶液Y 水 GPC:UltrahydrogelProtein-pakNY保存时间 检测器响应值t R(B)t R(A) tt 0t R(A)W(A)W(B)容量因子 k = = =VR - V0V0t R - t 0t 0t Rt 0VR = 保存体积 V0 = 死体积t

11、R = 保存时间 t 0 = 死时间tR = 相对保存时间 选择性 tR (B) - t 0tR (A) - t 0tR (B)tR (A) = =检测器响应值t R (B)t R (A) tt 0tR(A)W(A)W(B)柱效 别离度 R = = = t W t WA + WB22 t WA + WB检测器 响应值tR (B)tR (A) tt0tR (A)W(A)W(B)别离度R = = N2 t Wb1 4 - 1 k21 + k2柱效选择性容量因子色谱柱保存方法 色谱柱 : 用不与填料反响的溶剂填满 1) 正相色谱柱 : 正己烷 2) 反相色谱柱 : 清洗之后用60-70% 有机溶剂(

12、CH3CN, MeOH)填满 长期保管 : 100% MeOH, CH3CN3) 离子交换色谱柱 - 无机阴、阳离子色谱柱 长期保管: 10% CH3CN 短期保管: 流动相 or 5% CH3CN * IC-pak 阳离子色谱柱 : 2mM HNO3 - 有机阳离子色谱柱 长期保管: 10% EtOH 短期保管: 水，在 4 - 有机阴离子色谱柱 : 水，在44) 体积排阻色谱柱GPC色谱柱 : 指定的溶剂 Aqueous GPC 色谱柱 : 0.05% 叠氮化钠/水或 20% 有机溶剂Aqueous GFC 色谱柱 : 0.05% 叠氮化钠/水或 20% 有机溶剂色谱柱的清洗 1. 正相色

13、谱柱(柱容量的10倍) 甲醇-甲吡酮 氯化物-庚烷(异辛烷) 2. 反相色谱柱 (柱容量的10倍) 水-甲醇-氯仿-甲醇-水 3. 离子交换色谱柱 阳离子色谱柱 : 水-0.1M NaOH-水-30% 乙酸 (or 0.1N HNO3 ) 水 阴离子色谱柱 : 水-0.1M NaOH(12ml)-水- 30% 乙酸 (12ml) 4. 体积排阻色谱柱 流动相检测器检测器输出比例于样品量的电子信号 要求 1. 信噪比 : 高2. 噪音、漂移 :小3. 检测限 : 小4. 稳定的流速、温度、压力5. 梯度分析 6. 选择性检测限/定量限检测限 : S/N = 2 或 3定量限 : S/N = 大约

14、 10 检测器 光学检测器 1. 紫外/可见光检测器 2. 荧光检测器 3. 示差检测器 4. 蒸发光散射检测器ELSD 电化学检测器 1. 电导检测器 2. 电化学检测器检测器的特征对温度的敏感度RIUV/VIS荧光 电化学电导 响应 选择性对流速的敏感度u ssssugngpgpgngYESNONOYESYESYESYESYESNONOu : 通用性, s : 选择性ELSDuNO紫外/可见光吸收检测器光源中的特殊波长通过流动池，一局部被吸收、另一局部通过样品。 特定样品对特定波长的吸光度高。被吸收的光能比例于样品浓度 A = bc ( Lambert- Beers Law ) A : 吸

15、光度 : 摩尔吸光系数 b : 光程长 C : 样品的浓度紫外/可见光吸收检测器 1) 固定形 - 按光源可使用几个固定的波长 - 波长: 214,229,254,265,280,313,340,405,436,546nm 2) 可变形 - 在波长190-900nm范围中选择 灯流动池 光电二极管RS 样品入口Hg 254Zn 214Cd 229D2 可变UV 检测器To amplifier 3) 光电二极管阵列检测器 - 同时扫描190-800nm之间的波长光电二极管阵列检测器 氘灯 棱镜池子 全息光栅二极管阵列512 Diodes190 - 800 nm常用溶剂透过波长下限溶剂透过波长下限

16、溶剂透过波长下限水180n-庚烷197甲醇210环乙胺200n-丙醇二酸205四氯化碳265乙腈190氯仿245THF230苯280丙酮330甲苯285乙酸甲酯260二氯甲烷232乙酸乙酯260四氯乙烯280硝基甲烷3801,2-二氯乙烷225利用PDA检测器的药物分析 荧光检测器的光路图光源 反射镜子激发光滤光片激发光裂缝 调焦镜电子束分裂器 光电二极管流动池收集镜镜子发射光裂缝发射光滤光片 光电倍增管用FLD分析PAH组分 1 萘2 anthraquinon 蒽醌3 acenaphthylene4 acenaphthene 5 fluorene 6 phenanthrene 7 anthr

17、acene 8 fluoranthene 9 pyrene 10 benzo(a)anthracene 11 chrysene 12 benzo(b)fluoranthene 13 benzo(k)fluoranthene 14 benzo(a)pyrne 15 dibenzo(ah)anthracene 16 benzo(ghi)perylene 17 indeno(123-cd)pyrne样品平均 水 色谱柱 HP PAH 250 x 2.1mm (22C) 流动相 水/已胫 梯度分析检测器 UV/VIS 270nm FLD EX=275, EM=350 示差折光检测器原理 - 测定根据样

18、品浓度变化而改变的折射率之差 - 流动池 : 样品池、参品池- 参品池是以流动相填满 分析期间流动相只流过样品池 应用范围 - 聚合物, 糖 - 用于分析以紫外检测器和荧光检测器无法检测的样品Structure of RI Detector应用于凝胶渗透色谱系统 测定高分子物质的分子量 - 用标样画出校正曲线，用决定未知样品的分子量 分析条件 - 检测器 : RI 检测器 水溶性 GPC 脂溶性 GPC 色谱柱 Ultrahydrogel Styragel(HR, HT) 标样 支链淀粉 苯乙烯GPC色谱图使用 RI检测器分析糖电化学检测器 当组分被氧化或还原时, 电流与浓度成比例参比电极工作

19、极电解 (流动相)辅助电极分析物被氧化(+)/还原 (-)ELSD 检测器 ZAM 3000ELSD 检测器 ZAM 3000 是高灵敏的通用检测器ELSD检测用紫外检测器、示差检测器无法检测器的物质，可检测任何不挥发性物质，而且还可用于梯度洗脱。ZAM 3000工作原理雾化器样品溶液流出液被特殊制作的玻璃雾化器雾化。样品处理样品被雾化之后，一局部蒸发带到检测器，大局部被凝成小滴掉下排出。雾化器和蒸发管的材质是玻璃，因此不易被化学侵蚀，而且易于清洗。检测器的气体流速喷雾气体在蒸发管内被与辅助气体和混合。检测器位于蒸发管上端喷雾气体辅助气体废液检测池结构蒸发管检测室LED 光源LED光源长时间提

20、供稳定光能。分析磷脂组分:Phosphatidyl choline / Lysophosphatidyl choline色谱柱:Merck Lichrospher 100diol-5 125 x 4 mm色谱柱温度: 40 C溶剂:梯度洗脱A: n-正己烷 / 2-Propanol / 乙酸/ 三乙胺B: 水 / 2-Propanol / 乙酸/ 三乙胺ELSD-Detection:气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar气体 流速 (辅助气体): 1,7 L/min温度: 50 C分析糖组分:Xylose / Glucose / Saccharose / Lactose色谱柱:HyperS

21、il APS, 5, 250 x 4.6 mm色谱柱温度: ambient溶剂:乙腈:水 90:10, 流速: 1,0 mL/minELSD-检测:气体 压力 (喷雾气体): 1,6 bar气体 流速 (辅助气体): 1,5 L/min温度: 50 C分析有机酸溶液组分:Malic acid / Succinic acis / Fumaric acid色谱柱:Inertsil ODS-3, 5 m, 250 x 4,6 mm色谱柱温度: ambient溶剂:0,01% Trifluoro 乙酸(TFA) in 90/10 甲醇/水.ELSD-Detection:气体 压力 (喷雾气体): 1,

22、6 bar气体 流速 (辅助气体)： 1,5 L/min温度: 50 C分析聚苯乙烯标样混合剂组分:Polystyrene mix 18700 / 8300 / 2360色谱柱:Jordi Gel DVB, 500 , 500 x 10 mm 色谱柱温度: ambient溶剂:THF, 流速 1 mL/min.ELSD-Detection:气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar气体 流速 (辅助气体): 1,1 L/min温度: 35 C分析聚乙二醇组分:Polyethylene Glycol色谱柱:OptoSil ODS-2, 5 m, 300 x 4 mm色谱柱温度: ambient溶

23、剂:梯度洗脱 A: 水/甲醇 80/20 B: 水/甲醇 50/50 流速 : 1mL/min ELSD-Detection:气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar气体 流速 (辅助气体): 1,5 L/min温度: 50 C分析高级醇组分:Higher Alcohols色谱柱:Inertsil ODS-3, 40 x 4 mm溶剂:水/乙腈 5/95 ELSD-Detection:气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar气体 流速 (辅助气体): 1,5 L/min温度: 50 C检测尿素组分:Urea 5mg/100 mL in 80/20 乙腈 / 水色谱柱:溶剂:80/20 乙腈 / 水 ELSD-Detection:气体 压力 (喷雾气体): 1,0 bar气体 流速 (辅助气体): 1,1 L/min温度: 25 C用ECD检测儿茶酚胺电导检测器流动相流动相和样品用电导检测器分析阴离子色谱 数据工作站 控制器 数据处理 网络工作工作站的开展历程溶剂溶剂的条件 流动相 - HPLC