HPLC同时测定护肝片中5种成分的不确定度分析

1、HPLC同时测定护肝片中5种成分的不确定度分析【摘要】目的：建立HPLC法测定护肝片中腺背、五 味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的不确定 度评定方法。方法：根据测量不确定度评定与表示的有 关规定，分析影响含量结果不确定度的因素来源，并对各不 确定度因素进行评定，计算合成不确定度，最终给出扩展不 确定度和报告不确定度。结果：不确定度评估为腺昔081%, 五味子醇甲086%,五味子酯甲067%,五味子甲素074%, 五味子乙素078%。结论：对照品的配制、样品溶液、进样 重复性的不确定度是肝片5种成分不确定度的主要来源。【关键词】HPLC；护肝片；腺甘；五味子醇甲；五味子 酯甲；五味子

2、甲素；五味子乙素；不确定度【中图分类号】R2841【文献标志码】A【文章编号】 1007-8517 (2016) 10-0033-04Abstract： Objective To establish a HPLC method for uncertainty analysis of Adenosine Schisandrin Schisantherin Deoxyschizandrin and Schisandrin B in Hugan Tabelts. Methods According to the technical requirements of Evaluation and exp

3、ression of uncertainty in measurement, each active component of uncertainty was calculated the variable 成分的含量为X腺=029mg/片，X醇=056mg/片，X酉旨二013mg/ 片，X甲=014mg/片,X乙=029mg/片。那么5种成分含量的相 对合成不确定度分别为mg/片，Ux g?=056X086%=00048mg/ 片，Ux 酯=013X067%=00009mg/片，Ux 甲二014X 074%=00010mg/t，Ux 乙=029 X 078%=00023mg/片。36计算扩展

4、不确定度及测量结果取95%的置信概率，包 含因子匕2,那么U=2XUx,本次实验所测量样品的含量及不 确定度见表3。4讨论分析评估不确定度，应尽量注意产生不确定度的所有来 源，因为合成不确定度的数值取决于重要的不确定度分量。 从表2各标准分量的不确定度可知，本研究测定护肝片中5 种成分结果的各分量不确定度均较小，测量结果的不确定度 主要来源于对照品的配制和样品溶液进样重复性的不确定 度。在分析了上述影响测量不确定度原因后，在以后的试验 中加以注意和改进。选择精密度高的单标线移液管，尽可能 减少量取的次数并尽量选用容量相对大的量具，样品测量应 在基线平稳后进样，同时尽量保持标准溶液和供试品溶液测

5、 定条件相同，使测量结果更加可靠，测量结果的不确定度进 一步减小。本研究所建立的方法考虑了 HPLC测定过程中产 生不确定度的大局部因素，为同类方法测量结果的不确定度 评定提供有益的参考。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)M. 北京：化学工业出版社，2010.2测定不确定度评定与表示S JF1059-1999.3杨瑞，董晓茜，唐思，等.LC-MS法测定人血浆中五 味子醇甲的不确定度评定J.药物评价研究，2015, 38 (1)： 61-65.4赵昕，温瑞卿，王鑫，等.不确定度评估在双黄连口 服液定量检验中的应用探讨J.中国药事，2015,(9)： 951-957.5王磊，烟台

6、，姚令文，等.甘遂中大戟二烯醇HPLC 定量方法的测量不确定度评定J.中国药事，2015, (2)： 147-152.丁军霞，顾志荣，孙宇靖，等.HPLC测定当归5种化 学成分不确定度评定J.中国中医药信息杂志，2015,22(12)： 75-78.7张彬，周学兴，李蓉，等.强力枇杷露相对密度测定 的不确定度评定几中国中医急症,2015, 21 (7)： 1995-1196. 赵昱玮，南敏伦，吕娜，等.原子荧光光谱法测定五 味丹草片中碑的不确定度评定J.中国医药指南，2015, (5)： 56-58.(收稿日期：20160323) parameters among the procedures

7、. The combined uncertainty and extended uncertainty reported Uncertainty were finally obtained by synthesized the uncertainties of various component variables. Results The uncertainty for Adenosine was081%, Schisandrin was086%, Schisantherin was 067%, Deoxyschizandrin was074%and Schisandrin B was078

8、%. Conclusion The uncertainty of reference standard qualrity was the main source of five components measurement uncertainty in Hugan Tabelts.Keywords： HPLC； Hugan Tabelts； Adenosine； Schisandrin； Schisantherin； Deoxyschizandrin； Schisandrin B； measurement uncertainty护肝片由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆 等六味中药经提取

9、、加工制成的中成药，收载于2010年版中国药典一部口,具有疏肝理气，健脾消食，降低转氨 酶的功效，临床用于慢性肝炎及早期肝硬化等。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性， 与测量结果相关联系的参数2,它是被测量客观值在某一量 值范围内的一个评定，其大小决定了测量结果的实用价值。 测量不确定度是评价定量方法的可靠性与测量结果的可信 程度的主要内容之一，其重要性已得到广泛认可。目前，测 量不确定度的评定在环境分析、食品检验、药物分析等领域 得到深入的研究和广泛的应用3-8。研究根据测量不确定 度评定与表示（JJF1059-1999）中有关规定，对护肝片中5 种成分含量的测量不确定度进行分析

10、，以找出影响不确定度 的因素，对不确定度进行评估，为评价检测报告提供理论依 据，以控制测量结果的有效性和适宜性。1仪器与材料11仪器Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent 1200 LC色谱工作站、G1322A DEGASSER溶剂脱气机、G1311A四 元泵、G：1329A自动进样器、G1314BVWD紫外检测器）； CP225D电子天平（德国赛多利斯）；COBOS AW-120自动电 子天平（西班牙）；SB3200WS超声波清洗器（上海必能信）; Type HT-203A column HEATER （天津市恒奥科技开展有限公 司）。12材料 腺首（批号：110879-

11、200202）、五味子醇甲（批 号：110857-201412） 五味子酯甲（批号：111529-200302） 五味子甲素（批号:0764-200107）和五味子乙素（批号： 110765-200407）对照品均购自中国药品生物制品检定所。护 肝片（批号：20130512、20141122,黑龙江葵花药业股份有 限公司;批号：20公0702,广东省惠州市中药厂）。 乙睛为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。2方法与结果21 色谱条件色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18 (250X46 mm, 5um）；流动相：乙月青（A） 07%磷酸溶液（B）梯度洗 脱（见表1）；流速：

12、08 ml/min；检测波长：。14min, 260nm； 1401-58min, 250nm；柱温：30；进样量：10 uL 理论 板数按腺昔计应不低于2500o22溶液的制备221混合对照品溶液的制备分别精密称取腺甘、五味子 醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品1469、 1980、989、1112、1138 mg 置 25ml 量瓶，加 50%甲醇溶解 并定容至刻度，分别配制成对照品贮备溶液；各精密取2ml 置25ml量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度（含腺昔 00470mg/ml五味子醇甲00634mg/ml、五味子酯甲 00316mg/ml五味子甲素00356mg/ml、

13、五味子乙素 00364mg/ml的溶液）即得。221供试品溶液的制备取本品10片，除去包衣后，精密称定，研细，取约1片的 量，精密称定，精密加入50%甲醇20mL,称定重量，超声 处理（功率250W,频率40KHz） 50min,放冷，用甲醇补足 减失的重量，摇匀，滤过，滤液用045 um微孔滤膜滤过， 取续滤液，即得。222阴性对照溶液的制备按处方中药味的比例，分别自 配不含板蓝根和不含五味子的群药，按其工艺制成阴性对照 样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。23方法学考察231线性关系的考察精密称取腺甘、五味子醇甲、五味 子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，以50%甲醇 为溶

14、剂，配制成混合对照品溶液。倍比稀释法配置成系列质 量浓度的溶液。进样10口1,测定各组分峰面积。以各组分 浓度（C）横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲 线，得回归方程。腺昔：A=38133 C+13918, r=09998；五味 子醇甲:A=20180 C+11309, r=10000；五味子酯甲：A=14253 C+59979, r=09999；五味子甲素：A=17825 C+38007, r=10000； 五味子乙素：A=26780 C-15709,二09999。232精密度试验精密吸取同一供试品（批号：20130512） 溶液10口1,按上述色谱条件进样，测定腺甘、五味子醇甲、

15、 五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积，重复进样 6 次，其 RSD 分别为 085%、059%、105%、076% 081%。233重复性试验取同一批样品（批号：20130512）约1 片的量共6份，精密称定，分别制备供试品溶液，各进样10 口1,测定腺昔、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五 味子乙素的含量，结果RSD分别为：183%、139%、221%、 179%、150% o234稳定性试验取同一供试品（批号：20130512）溶液, 分别在0、1、2、4、6、8、10、12h时进样10 口 I,记录色 谱峰面积，计算腺昔、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲 素和五味子乙素的峰面

16、积的RSD分别为152%、088%、191%、125%、095%o235加样回收率试验精密量取已测定腺甘、五味子醇甲、 五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素含量的护肝片(批号: 20130512)样品9份(每份约05片的量)，精密称定，每份 分别精密加入一定量的腺甘、五味子醇甲、五味子酯甲、五 味子甲素和五味子乙素对照品，制备供试品溶液，进样测定, 计算加样回收率，结果平均回收率分别为9945%、10010%、 9919%、9969%、9988%。RSD 分别为：159%、150%、178%、 171%、150%03不确定度来源的识别及分析31不确定度的来源从检测过程和数学模型分析，样品中 5种

17、成分含量的相对标准不确定度?Urel来源，主要包括： 对照品溶液浓度的相对标准不确定度Urel(Cs)；供试品溶 液配制过程引入相对标准不确定度Urel (V)；HPLC测定峰 面积相应值的相对标准不确定度Urel (A)、Urel (As)。即：Urel=U2 rel (Cs) + U2 rel (V) + U2 rel (As) + U2 re I (A)32对照品溶液浓度的相对标准不确定度Urel (Cs)： Urel (Cs)的来源：对照片的纯度的不确定度；对照品的称 量所产生的相对不确定度Urel (ms)；配制对照品溶液产 生的相对不确定度Urel (Vs)o321对照品的纯度的不

18、确定度对照品腺甘、五味子醇甲、 五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均购自中国药品生物 制品检定所，由于尚无法得到不确定度参考值，故此项忽略。322对照品的称量所产生的相对不确定度Urel (ms)检 定证书中1/10万天平称量允差为OOImg,按矩形分布计算不 确定度为u (msl) =001/3=00058mg；该天平称量时重复性 标准偏差为OOlmg,即u (ms2) =001mg；腺甘、五味子醇 甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素5种对照品的取 样量分别为1469, 1980, 989, 1112, 1138mg,那么对照品称 量所引起的相对标准不确定度为：腺背：Urel (ms 腺

19、)=u (msl) 2+u (ms2) 2m=000582+00121469=008%同理五味子醇甲：Urel (ms醇)=006%；五味子酯甲： Urel (ms 酯)=012%；五味子甲素：Urel (ms 甲)=010%； 五味子乙素：Urel (ms乙)=010%。323对照品溶液配制的相对不确定度对照品溶液配制过 程中分别使用了 25ml量瓶与2ml移液管，其不确定度分别 如下：校准，A级25ml量瓶、2ml移液管的允许偏差分别 为003ml, 001ml,按矩形分布计算不确定度为 003/3=00173ml, 001/3=00058ml；重复性,用 A 级 25ml 量瓶与2ml移

20、液管重复吸量蒸储水10次，测得重复性不确 定度 u (Vs25) =00034ml, u (Vs2) =00010ml；温度，环 境温度为室温(205),溶剂水的体积膨胀系数为21X10-4,按矩形分布，环境温度引入的不确定度为u (Ts25)= (5X21X10-4X25) /3=00152, u (Ts2)= (5X21X10-4X2) /3=00012o对照品溶液配制过程中分别使用了 25ml量瓶2次，2ml 移液管1次,因此对照品配制过程的引入的相对不确定度为：Urel (Vs25) =001732+000342+00152225=009%Urel (Vs2) =000582+0001

21、02+0001222=030%Urel (Vs) =2X000092+000302=033% 因此，对照 品溶液浓度引入的相对不确定度分别为：腺昔：Urel (Cs腺) =000082+000332=034%；同理五味子醇甲：UreKCs 醇)=034%； 五味子酯甲：Urel (Cs酯)=035%；五味子甲素：Urel (Cs 甲)=035%；五味子乙素：Urel (Cs 乙)=035%。33供试品溶液配制过程中引入的相对标准不确定Urel(V)供试品溶液在配制过程中使用了 20ml移液管，其不确 定度如下：校准，A级20ml移液管的允许偏差为003ml, 按矩形分布计算不确定度为003/3=00：173mI；重复性，用 A级20ml移液管重复吸量蒸储水10次，测得重复性不确定 度u (Vs20) =00030ml；温度，环境温度为室温(205) , 溶剂水的体积膨胀系数为21X10-4,按矩形分布，环境温度 引入的不确定度为 u(Ts20)=(5X21X 10-4X20)/3=00122。 那么