医学遗传学：第十一章 遗传病的诊断

1、10 第十一章 遗传病的诊断Diagnosis of genetics disorders2教学目的 了解：基因诊断在遗传病诊断中的应用及进展掌握：1遗传病的现症患者诊断及症状前诊断2产前诊断的指征及实验室检查3基因诊断的基本技术及其原理教学难点遗传病实验室检查方法的综合应用和分析3临床遗传学 将医学遗传学理论知识应用于临床实践，包含遗传病的诊断、治疗、咨询和预防 遗传病的诊断遗传病的治疗遗传咨询遗传病的预防4遗传病诊断目的 由于多数遗传病还没有理想的治疗方法，目前临床遗传学的重点是如何诊断遗传病，特别是产前诊断，以达到防止有致命及严重致残的遗传缺陷的患儿出生5第一节 遗传病的临床诊断遗传病诊

2、断的分类* 现症患者诊断 symptomatic diagnosis* 症状前诊断 presymptomatic diagnosis* 产前诊断 prenatal diagnosis 61. 病史的收集一般病史：患者的一般发病情况家 族 史: 本病在家族中的发病情况婚 姻 史：有无近亲结婚等生 育 史: 生育年龄，子女健康状况 有无流产、死产、早产 有无药物、放射线接触史等 一、临床诊断7实验室检查：细胞遗传学检查、基因诊断X线、超声、心电图、脑电图等 2. 一般检查共同性：遗传病的症状和体征与其它疾病特殊性：遗传病的特异性征候群生长发育迟缓：体格、智力发育第二性征：性器官发育情况3. 临床辅

3、助检查8女婴，3月龄，因哭闹后面部青紫就诊足月顺产查体：精神呆板,眼距宽,双眼外侧上斜,耳位低，四肢短,肌张力低,心尖部级舒张期杂音,胸透心脏无扩大,腹软,肝脾不大 Case 1Down Syndrome?9眼裂小眼距宽眼裂上斜鼻梁低平临床表现：特殊面容Down Syndrome10通贯手正常人 2%患者 50%临床表现：特殊掌纹 Down Syndrome11细胞遗传学检查（核型分析、FISH） 21三体FISH1213取得家系成员的知情同意详细调查家族遗传史，绘制家系遗传图谱对患者进行详细的医学检查获取疾病资料14家系中17名患者均为男性，典型的X连锁隐性遗传家系 15通过文献分析，我们发

4、现该家系的临床表型与1999年Gedeon等在Nature上报道的家系非常相似他们采用连锁分析的方法将致病基因定位到Xp22，并命名为SEDL，他们还发现该基因的 缺失突变（191-192delTG）导致了这种疾病。文献调研16 患者经常体表的伤口出血不易凝结，膝关节常有肿胀、青紫、疼痛，伴站立行走困难 体检发现双膝关节畸形，关节的功能异常。患者的两个哥哥均有类似的症状Case 217临床体征：患者的体征及X线检查双膝关节变形伴功能障碍X线影像显示关节腔变窄18临床资料分析由病人的临床症状可判断病人患出血性疾病 实验室检查病人血浆内缺乏F8，导致凝血功能缺陷，患者受轻微外伤后即出血不止，并可形

5、成皮下血肿。关节、肌肉出血常累及膝、踝，导致跛行口腔粘膜出血19系谱分析III13212先证者及其两个哥哥都为患者，由于甲型血友病为X连锁隐性遗传病，其致病基因一定由母亲遗传而来，先证者的母亲（I2）则为携带者或患者20系谱分析往往是根据先证者的症状、体征、实验室检查和其它辅助检查明确疾病诊断后，追溯家系中其他成员，画出系谱图 系谱分析 pedigree analysis21系谱分析的目的是否为遗传病总结出遗传方式221、职业的选择2、早预防早治疗3、避免患儿出生对未成年人遵循有益无害的原则二、症状前诊断231221 49 123123Huntington舞蹈症家系系谱22 51 22 23

6、24 52 IT15基因CAG A premutation (27 to 35 CAG repeats) 24 三、产前诊断产前诊断（prenatal or antenatal diagnosis） 又称宫内诊断（intrauterine diagnosis）是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作准确的诊断产前诊断的适应症的选择原则 是有高风险而危害较大的遗传病 目前已有对该病进行产前诊断的手段251、是母婴保健法规定的母婴保健技术服务，服务面广，社会期望值高2、产前诊断是预防出生缺陷的二级措施，是提高我国出生人口素质不可缺少的技术手段3、产前诊断技术是妇幼保健高技术服务。特别需

7、要科学规划、依法监管，保障这项技术的持续、健康发展产前诊断工作的重要意义26（一）背景1、依法服务的客观要求，母婴保健法法律体系 的组成部分2、产前诊断技术服务存在的问题和健康发展的客观 要求3、群众对产前诊断技术服务需求增加，依法管理势 在必行制定产前诊断技术管理办法的背景与目的271、对产前诊断的重要意义缺乏基本认识。缺乏政策 导向、宏观规划和监督管理 2、缺乏人才：临床和遗传学知识与技能俱佳的专业 人员严重匮乏、B超权威少等3、缺乏必要技术标准和规范。技术低水平重复，设 施、设备落后产前诊断技术服务存在的一些问题28 4、服务不成体系，缺乏权威产前诊断机构，尚未 形成自下而上、特色互补的

8、合作机制，“纵”、 “横”沟通的信息反馈、公开机制，未形成规模 效应 5、筛查以经济利益为导向，试剂使用混乱，收费 混乱 6、需方的意识、支付能力和风险防范问题。知情 同意未实现“规范告知”，易引发纠纷29（一）医疗服务中的相关法律问题 1、消费自由权 2、知情权：病情、措施、风险 3、选择权 4、医疗服务提供者和消费者的法律契约 知情同意书 5、证据：医疗规范、技术标准、医疗记录、 结果等产前诊断中的法律问题30 产前诊断医疗事故 产前诊断医疗事故的客体是母体 因为胎儿具有生物学特征，无社会学特征，胎儿 是生命客体，但是依赖性的，与外环境没有新陈 代谢关系，没有权利和义务 公民的权力是：出生

9、 死亡 如果产前诊断造成对胎儿的伤害，实际上是对母 体的伤害31产前诊断纠纷的预防接受服务的孕妇要签“同意书”“同意书”与“知情书”是有本质区别的同意书必须包含的内容是：“我知道产前诊断（筛查）的作用、意义、风险、结果，我自愿接受服务，后果自己负责”等等32每一步都要写“同意书”产前筛查风险（假阴性、假阳性）、收费产前诊断风险、收费诊断结果处理收费、风险 （终止任娠：小孩没了 不终止任娠：可能生下有缺陷婴儿）每一步都有知情选择权33产前诊断重点人群的确定： 重申母婴保健法规定的应进行产前诊断的几种情形 羊水过多或过少； 胎儿发育异常或者胎儿有可疑畸形 早期致畸接触史 有家族遗传史或曾分娩过缺陷

10、儿的 年龄达或超35岁34染色体病产前筛查适应征唐氏筛查高风险孕妇高龄孕妇（分娩年龄35岁）曾生育过染色体异常患儿者有不明原因的自然流产史、畸胎史、死胎及新生儿死亡史的孕妇丈夫在孕前及妻子在孕早期接触过致畸因素羊水过多、宫内发育迟缓或疑为严重宫内感染的孕妇35血清学筛查超声波检查核磁共振检查胎儿镜检查细胞遗传学及分子遗传学检查侵入性检查： 羊膜穿刺术 羊膜穿刺亦称羊水取样 绒毛吸取 绒毛可经腹部（宫颈部）取样 脐血管穿刺术非侵入性检查：无创基因检测 目前临床采用的几种主要产前诊断方法36孕期的筛查与诊断胎儿健康状况的检查分为: 筛查 诊断 筛查：是针对胎儿是否有发生某种遗传病高风险进行的筛查方

11、法: 简单，费用低，通量高，获得结果快速诊断：诊断性检测必须建立在先症者确诊基础上, 是有目的性的产前诊断中应遵从：筛查在先, 诊断在后的原则37产前筛查对表型正常的人群进行产前筛查38 筛查出较高可能孕育异常胎儿的高风险人群产前筛查39产前诊断 高风险人群最后通过诊断性措施，如绒毛、羊水或脐带血穿刺等方法确诊异常胎儿40我国现行唐氏筛查与二级预防模式 产前筛查（唐筛） 母血清学筛查 超声颈部透明带（NT）筛查 产前诊断 羊水穿刺 绒毛取样 脐静脉穿刺风险评估产前诊断（行业金标准）5%假阳性率40%漏诊存在一定流产风险41 早孕期唐氏筛查（在11-13+6周采血） PAPP-A+-HCG 结合

12、检出率更高 中孕期唐氏筛查（在14-20+6周采血） AFP+游离-HCG+uE3 21-三体、18-三体、神经管缺陷 早、中孕期联合筛查唐氏综合征产前筛查4243全国妇幼卫生检测办公室的调查显示： 20072009年全国产筛 4097801人，其中T21高风险176130人，占4.23%；而接受产前诊断的93504人，约53.08%，即有46.92%拒绝接受产前诊断；确诊为T21胎儿6679例，仅7.14%，即接受产前诊断的人群中92.86%被高危了(假阳性)现行传统唐氏筛查体系存在的问题44无创产前胎儿DNA（cffDNA）检测技术Cell-free DNA (cfDNA)cfDNA co

13、mes from apoptotic cells derived from:Maternal CirculationAdipocytesWhite Blood CellsFetal Placental cells (trophoblasts) in the maternal circulation46NIPT history1997 : Lo et al. :cff DNA in maternal circulation2001 : Fetal Rh(D) genotype 2006 : Sexing fetus for :X-linked genetic disordersSexing (C

14、hina)2011 : Detection trisomy 21/18/13 2012 : 100.000 NIPTs in USA and China 2014 : 500.000 NIPTs in USA, Europe and China 2015 : 1.000.000 NIPTs in USA, Europe and China2016 : 1.000.000 NIPT tests worldwideY. M. DENNIS LO48母体外周血的游离胚胎DNA几乎全部来源于绒毛层怀孕4周可检出，8周后含量逐渐上升并稳定存在胚胎DNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间母体外周血

15、中的胚胎DNA含量在5%到30%之间(11-17w: 0.39-11.9%, 妊娠晚期2.33-11.4%，相比之下有核胎儿细胞仅占0.0035%-妊娠中期，0.008%-妊娠晚期)。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高胎儿游离DNA半衰期短(数分钟)，产后2h即基本消失，产后2月PCR即检测不出胎儿游离DNA特征Massively Parallel Shotgun SequencingTargeted SequencingSequenomMaterniT21TMVerinataVerifiAriosaHarmonyTMTargeted SequencingNateraPanoramaTMCO

16、UNTINGSNPsDifferentiating NIPT Methodologies50异常：母体+胎儿共115条检测原理1总体数量差异正常：母体+胎儿共110条胎儿染色体非整倍体导致母血浆中游离DNA剂量变化51SNPs: Single Nucleotide Polymorphism检测原理210 ul52假阳性：误诊，实际无病，但根据筛检被判为有病（提示高风险）需要进一步确诊（羊水穿刺、脐血穿刺）假阳性原因： 1.局限性胎盘嵌合型 21三体假阳性 2.单亲二体 21三体假阳性 3.母亲为非整倍体 X三体假阳性 4.母亲为实质性肿瘤 13三体假阳性无创产前胎儿DNA检测假阳性53假阴性：

17、漏诊，实际有病，但根据筛检 被判为无病（低风险）假阴性原因： 1.孕周过早 2.多胎 3.双胎消失 3.胎盘嵌合 5.标本处理不当无创产前胎儿DNA检测假阴性54不同类型的嵌合体552012年11月20日，美国妇产科学会（ACOG）与美国母胎医学会（SMFM）共同发表委员指导意见，若有以下适应症，可推荐使用无创产前胎儿DNA检测作为非整倍体高危人群的筛查： 母亲年龄超过35岁的 超声结果显示非整倍体高危的（软指标） 生育过三体患儿的 早孕期、中孕期或三联筛查、四 联筛查呈现非整倍体阳性结果的 父母为平衡罗伯逊易位，并且胎儿 为13三体或21三体高危国际无创产前胎儿DNA检测行业指南56 早孕期

18、检查正常后提示三种情况下孕妇可能 会希望进一步筛查T21、T18、T13风险： 孕期通过母亲年龄、NT值、母血清标志物或其他 超声指标计算有高风险 母亲高龄或生育过三体患儿，而不具有其他风险 指标的孕妇 希望进行无创产前胎儿DNA检测一线筛查的孕妇2014.6 cffDNA检测与超声检查结合应用指南57如果无创产前胎儿DNA检测结果正常，则早孕期超声NT 值和母血生化指标就不应针对T21、T18、T13进行计算如果先前无创产前胎儿DNA检测结果正常，但胎儿结构异常，就应采用核型或芯片分析进行侵入性产前诊断如果无创产前胎儿DNA检测结果正常，就不必在“遗传超声图谱”中寻找包含指示T21的软指标，

19、因其具有很高的假阳性率及很低的阳性符合率如果孕妇联合血清筛查高风险或中风险时，则可探讨无创产前胎儿DNA检测作为替代侵入性产前诊断的一种检查手段（慎用）2014.6 cffDNA检测与超声检查结合应用指南58无创产前胎儿DNA检测（筛查）在一线产前筛查中的价值国际三大前瞻性临床试验国家参与中心覆盖孕周样本数群体组成试验时间论文发表杂志中国2个中孕期1916低龄样本2011-12年Prenatal Diagnosis英国1个早孕期1005随机样本2012-13年Ultrasound Obstetrics&Gynecology美国21个早中晚孕期1914随机样本2012-13年New Englan

20、d Journal of Medicine提高了准确率，降低了漏诊率59总结：无创产前胎儿DNA检测检测适应症1. 高龄（年龄35岁），不愿选择有创产前诊断的孕妇2. 唐筛结果为高风险或者单项指标值改变，不愿选择有创产前诊断的孕妇3. 孕期B超胎儿NT值增高或其它解剖结构异常, 不愿选择有创产前诊断的孕妇4. 不适宜进行有创产前诊断的孕妇，如病毒携带者、胎盘前置、胎盘低置、羊水过少、RH血型阴性、流产史、先兆流产或珍贵儿等5. 羊水穿刺细胞培养失败不愿意再次接受或不能再进行有创产前诊断的孕妇希望排除胎儿21-三体、18-三体、13-三体综合征，自愿选择行无创产前检测的孕妇6. 血清筛查阳性的孕

21、妇以及对产前诊断有心理障碍的孕妇60强调：无创产前胎儿DNA检测临床应用范围所有12-24孕周活产单胎人群所有希望用唐氏筛查降低胎儿染色体非整倍体风险、并自愿接受该项检查的孕妇孕周超过20w，错过唐氏筛查机会的孕妇分娩时35岁以上，超过唐氏筛查适应年龄的孕妇唐氏筛查高风险或临界风险（1/270风险1/1000)，不合并超声异常的孕妇唐氏筛查高危，对侵入性产前诊断有顾虑的孕妇（拒绝穿刺、试管婴儿等 “珍贵儿”）唐氏筛查高危，对侵入性产前诊断存在禁忌症的孕妇(胎盘低置或前置状态、先兆流产、感染等)61切记：无创产前胎儿DNA检测不适于范围有直接产前诊断指征的孕妇（如多处明显超声异常）多胎的孕妇（目

22、前可以做）夫妇双方有明确染色体异常的孕妇胎儿怀疑有微缺失综合征或其他染色体结构异常的孕妇经过可能引入外源性DNA治疗（如异体输血1年以内、移植、淋巴细胞皮下注射免疫治疗1月以内）的孕妇6299%的准确率假阳性率极低只需5-10ml孕妇静脉血无需空腹采血无宫内感染和流产风险孕12周即可检测10工作日内出报告60-80%的准确性假阳性率为5%需空腹采血结合B超只能检测21和18-三体，不能检测13-三体侵入性取样方式，孕妇心理压力大有宫内感染和流产风险 存在标本被污染或细胞培养失败的风险不适宜病毒携带者、胎位特殊者、Rh阴性血者等特殊情况普通唐筛产前诊断无创产前DNA检测唐氏筛查和介入性产前诊断面

23、临的问题63 采血前，孕妇必须先签署 无创产前基因检测送检 单/知情同意书 背面为保险知情同意书知情同意原则经治医生也要在知情同意书上签名！64报告解读T21：高风险切记：筛查提示高风险，一定需要做诊断羊水穿刺（孕18-22周）脐血穿刺（孕23-28周）引产胎儿(组织及胎盘组织)65 21-三体样品编号：11A3128孕妇年龄：28孕周：20无创结果：提示21-三体高风险核型分析：47，XX，+21临床应用案例166无创产前胎儿DNA检测假阴性临床应用案例2孕妇年龄：23？无创结果：提示21-三体高风险（系统B超检查肺部有阴影，建议做无创产前胎儿DNA检测）足月分娩：胎儿出生体重2400g-2

24、500g新生儿外周血染色体核型：46，XY，i（21）（q10）（新生儿喂养困难就医，发现21-三体面容）此病案提示：需要关注宫内胎儿生长发育67无创产前胎儿DNA检测唐氏综合征流程图中孕唐氏综合征血清学筛查 孕16周21-三体风险值大于风险截断值（1/1501/270) 羊水穿刺孕18-22周21-三体风险值介于风险值（1/270 1/1000) 无创产前胎儿DNA检测提示：高风险提示：低风险 继续妊娠（按期产前检查）唐氏综合征无创产前胎儿DNA检测筛查 孕12-24周诊断为21-三体 终止妊娠诊断为正常核型 继续妊娠绿色箭头：拒绝羊水穿刺及羊水穿刺禁忌的孕妇充分告知孕妇及家属羊水穿刺和无创

25、基因检测方法的利弊，家属签字68无脑儿先天性卵巢发育不全69Lack of development of a fetal cranial vault leads to the neural tube defect known as anencephaly70Hb Barts水肿胎儿综合征地中海贫血71产前诊断的时间产前诊断需要预分析疾病的确诊突变基因产前诊断的可能性、采用什么途径产前杂合子或携带者筛查 在家系中检测杂合子在高发群体中筛查杂合子 XR疾病女性携带者的检出 产前基因诊断的时机及准备72产前诊断取材的途径和时机绒毛膜绒毛活检10 12周经阴道经腹壁羊膜腔穿刺 1520周脐带血穿刺 1

26、7 32周孕妇外周血中胎儿DNA或胎儿细胞 12周* 早孕诊断明确怀孕后，及时寻求产前诊断服务73绒毛吸取术借助超扫描器用能屈的套管或腰椎穿刺针吸取绒毛7475羊膜穿刺术 注射器穿越腹壁到羊腔抽取羊水7677魏XX，女，40岁，停经56天 G7P3B超：宫腔内可见胚芽及胎心，测值相当于56天遗传咨询：其子与5岁皮肤逐渐变黑，8岁视力开 始下降， 视物模糊至失明。逐渐不能 行走。死亡。北京儿童医院诊断X连锁的脑白质营养不良基因检测：X连锁ABCD1基因突变 （C.1201位点突变为T）病例1 ：突变意义明确的遗传病产前诊断78诊断：早孕建议：妊娠18周羊水穿刺行胎儿染色体核型分析 及胎儿突变基因

27、检测121234762134558岁死亡分娩后窒息13岁宫外孕人流人流791、X连锁隐性遗传方式，致病基因为ABCD1， 后代女儿 50%机会为携带者，儿子50%可能患病； 2、核实父母及家属ABCD1基因突变；3、18周预约羊水，ABCD1候选位点检测；遗传咨询意见：X卵子精子携带者正常患者正常双亲子代8012123476213455-1-2-2-7母亲该位点为（CT），突变携带者胎儿该位点遗传母亲的T致病突变，半合子父亲该位点C：正常女儿该位点（CT），突变携带者81（1）孕妇为ABCD1基因c.1201CT突变携带者；（2）孕妇羊水细胞检测到ABCD1基因c.1201位点突变基因型 T，

28、与死亡患儿突变基因型一致；（3）ABCD1 c.1201CT（p.R401W）的致病性已经有相关文 献报道： Takano H1, Koike R, Onodera O, Sasaki R, Tsuji S. Mutational analysis and genotype-phenotype correlation of 29 unrelated Japanese patients with X-linked adrenoleukodystrophy. Arch Neurol. 1999 Mar;56(3):295-300. 后续追踪： 外院终止妊娠，追踪引产胎儿脐血基因检测与产前羊水检测结

29、果一 致。并告诫父母女儿生育时需 要行遗传咨询及产前诊断本次实验结论：821、DMD外显子缺失产前诊断2、脊髓小脑共济失调产前诊断3、先天性厚甲症KRT16基因产前诊断类似病例产前诊断：83病例2：突变意义未明的遗传病张XX，G2P1，孕16周，生育代谢病患儿 家族史：家族内有代谢病患儿患儿病史：发育迟缓，喂养困难，6月夭折，尿代谢产物筛查C14 C14:1 C16显著升高，考虑长链脂肪酸代谢障碍基因检测结果：父母双方长链酰基辅酶A脱氧酶ACADL基因携带突变 丈夫： IVS9 c.878+2GC (可疑致病) 妻子：Exon14 c.1358 GA (意义未明)IVS9 c.878+2GCE

30、xon14 c.1358 GAExon14 c.1358 GA？841、患儿可能为常染色体隐性遗传病长链酰基辅酶A脱氧酶缺乏症，夫妻再生育后代发病风险25%；2、双方携带ACADL基因突变，但意义未明；3、核实父母家属ACADL基因突变，告知仅能针对羊水行ACADL基因检测，但不能确定突变与疾病关系；4、18周预约羊水，ACADL候选位点检测；遗传咨询意见：85羊水细胞检查出 Exon14 c.1358 GA (意义未明)，与母亲突变类型一致。羊水细胞测序结果：后续追踪：病人选择继续妊娠，出生行遗传代谢 病筛查86病例3 复杂的线粒体遗传病 病例3，G3P2, 孕25周，其子可疑线粒体疾病家族

31、史：可疑线粒体疾病家族史患儿病史：6岁，运动发育迟缓，3岁走路，步态不稳，智力比同龄儿童低，双侧拇外翻，酶活性测定复合物V酶活性缺陷，血清碱性磷酸酶，乳酸，氨及丙酮酸水平升高基因检测结果：6岁患儿线粒体DNA m.9101TG突变胎儿B超结果：单侧肾871、线粒体疾病复杂，羊水细胞基因检测不能反应是否患病；2、胎儿合并有单侧肾，提示高代谢组织发育不良，预后不良可能性大；后续追踪：外院终止妊娠，留脐血供研究，但是脐血采集量少，DNA量少，无胎儿组织样品，无法行后续研究遗传咨询意见：88卵裂球的微活检 即从2-8个细胞期的胚胎细 胞中分离出单个细胞进行检测胚胎的冻存 如果微活检技术快速，无需冻 存

32、即可送回子宫卵裂球的培养 其目的在于得到更多的细胞， 有利于诊断植入前诊断(PGD)的基本技术包括89PGD之卵裂球活检(d3)90 21号染色体单拷贝探针特异性检测91一、染色体病的遗传学检查1、细胞遗传学检查：常规的常染色体显带，高分辨显带2、分子细胞遗传学检查：荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH），qPCR，CGH等第二节 遗传学检查92家庭成员中有多个先天畸形者多发性流产的妇女及其丈夫根据症状和体征疑为先天愚型的小儿及双亲原发性闭经和不育症明显体态异常、智能发育不全，特别是伴有 先天畸形者各种具有标记染色体的恶性肿瘤可考虑进行染

33、色体检查93易位(translocation，t)相互易位(reciprocal translocation)94 罗伯逊易位 的类型D/D D/G G/G1314罗伯逊易位 Robertsonian translocation-rob95 21三体FISH96二、基因诊断(Gene diagnosis)利用分子生物学技术从DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法 97 材料来源广泛：外周血、活体穿刺组织 孕妇外周血、血斑等 症状前诊断：尤其对于一些延迟显性疾病 如Huntington舞蹈病 产前诊断：避免患儿出生，提高人口质量基因诊断的优势98 实验室基因基因检查的策略间接

34、诊断多态性连锁分析直接检测法99直接检测致病基因的突变。基因突变类型 缺失、点突变、重复、插入等 直接检测法直接诊断-100 直接检测致病基因本身的异常。通常使用 基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern 杂交，或通过PCR 扩增产物， 以检测基因点突变、缺失、插入等异常及 性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。 直接检测法101链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成Hb S。在缺氧情况下，HbS聚合形成长棒状聚合物，使细胞镰变变形能力低引起血粘度增高，导致溶血、贫血、血管梗阻性继发症状。诊断：血涂片亚硫酸钠“镰变试验”阳性发病机制镰形细胞贫血的Gene诊断102方法：Souther

35、n blot 珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAGGTG 谷Aa缬Aa镰形细胞贫血的Gene诊断103ASO探针诊断已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针标记后进行斑点杂交 镰形细胞贫血的Gene诊断Mutation S Gene Probe与异常S 杂交稳定Normal Gene Probe与正常 杂交稳定Probe104斑点杂交结果突变型遗传病的直接基因诊断镰形细胞贫血的Gene诊断正常探针突变探针/ /S S/S105突变型遗传病的直接基因诊断镰形细胞贫血的Gene诊断106BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe地中海贫血的基因诊断基因不同程度的缺失可引起不

36、同类型的地中海贫血直接基因诊断 缺失型遗传病的直接基因诊断107Southern blot 检测结果：14kb10kb缺失型遗传病的直接基因诊断12/-212/12- 2/ -2- - / - -缺4正常缺1缺2缺3- -/ -2108我国地中海贫血分布109地贫纯合子：致死性出生缺陷重型地贫:胎儿水肿综合征 早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症 无理想治疗方法重型地贫 出生后1年内发病 多于未成年前因严重贫血而夭折 输血和去铁治疗可维持,代价昂贵110地中海贫血产前筛查的问题 女，38岁，妊娠16周 G3P1 妊娠12周行无创基因筛查，筛查结果21、18、13三体为 低风险。妊娠14

37、周常规的血生化检测，血常规结果显示 MCV低于80fl，轻度贫血（Hb低于110g/L）。进一步做 地中海贫血基因检测，结果为- -SEA/。临床诊断：妊娠16周，标准型地中海贫血， - -SEA/（东南亚地中海贫血）遗传咨询：胎儿会不会是地中海贫血111建议：查配偶血常规，如果配偶血常规显示轻度贫 血同时MCV低于80fl，配偶需要做地中海贫 血检测结果：配偶为- -SEA/ ，与孕妇一样为标准型 地中海贫血） 建议：孕妇需做羊水穿刺排除胎儿是否为重型地 中海贫血- - - -SEA/ - -SEA 。 因胎儿有1/4概率 为重型地中 海贫血。经验：血常规检查的时间及无创基因筛查时间地中海贫

38、血产前筛查的问题112Hb Barts水肿胎儿家系的系谱图113重症地中海贫血： 0突变双重杂合子114地中海贫血基因检测报告115地中海贫血基因检测报告116DMD属XRDMD基因是最大的基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位E1 E2 E3缺失型遗传病的直接基因诊断117病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113DMD的基因诊断118应用DNA多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断 多态性连锁分析间接诊断119遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断120当致病基因虽然已

39、知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过 Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断 多态性连锁分析121通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断 遗传标记是基因组中的DNA 多态 如：RFLP、VNTR、SNP 多态性连锁分析122Southern blot-RFLP PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可 产生23kb、19kb 两种等位片段， 以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交PKU间接基因诊断实例123PKU间接基因诊断实例患者为19kb片

40、段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者124125 群体中每个个体DNA区域中等位基因 （或片段） 存在两种或两种以上的形式， 对基因功能没有影响，称DNA多态, 它 通过孟德尔方式遗传 DNA多态（DNA Polymorphism）常用做遗传分析中的标记126DNA分析中常用的遗传性多态性标记 RFLP 第一代多态性标记 重复序列多态性（VNTR） 第二代多态性标记 单碱基多态性（SNP） 第三代多态性标记127限制性片段长度多态

41、性 Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或 新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用 同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA 片段，称 RFLP。RFLP按孟德尔（共显性） 方式遗传128Allele II 产生了新的酶切点 Allele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouthern blot检测结果 129AlleleII酶切位点消失 130131132数目变异串联重复(variable number tandem repeats, VNTR）重复序列以各自

42、的核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列重复次数在人群中存在变异，形成多态散在分布于染色体上 DNA多态 小卫星DNA：重复单位625bp长微卫星DNA：重复单位26bp长133 VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切 点之间的串联重复拷贝数不同，酶切 后产生不同长度的片段 DNA多态数目变异串联重复(variable number tandem repeats, VNTR）134VNTR 酶切，电泳后的检测结果大小 DNA多态135PCR-VNTR DNA多态136原理： 具有互补能力的特定核苷酸序列（单 链DNA或RNA）-探针（probe）杂交类型： Southern blotting， Northern blotting Dot blotting分子杂交技术137 Northern Blotting138点样Probe-32P检测AB1 2 3 4 Dot Blotting139 将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍， 从而大大提高对DNA分子的分析和检测能 力，能检测单分子DNA或对每10万个细 胞中仅含1