胞核胞浆胞膜制备试剂盒

1、 技术咨询电话：400-607-9999注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途捌胞核胞浆胞膜制翱备试剂盒把 版Nucl-Cy埃to-Mem 按Prepara傲tion Ki稗t安货号：柏P060004瓣描述：班从哺乳动物新鲜矮或冻存的组织块稗、贴壁或悬浮培唉养细胞中，制备胺细胞核、细胞膜碍与胞内质膜、细叭胞浆等三种主要摆亚细胞组分。独隘特的试剂成分与瓣优化的制备方案挨相结合，使胞核捌-案胞膜般-阿胞浆制备过程简瓣单易行，无需特岸殊设备和超速离伴心，制备过程可奥在蔼1案小时内完成。制岸备的细胞核、细奥胞浆组分纯度甚疤高，而且较少交疤叉污染。单一的把细胞膜的纯化是罢一个特殊问题，奥本

2、试剂盒制备的班胞膜是细胞膜和靶细胞器如线粒体胺、内质网、高尔蔼基体及其质膜的芭混合物。制备的皑细胞核是完整的懊未裂解的细胞核岸，但胞浆组分为啊可溶性胞浆蛋白袄。制备的亚细胞皑组分的纯度可胜澳任后续免疫共沉袄淀、安SDS-PAG巴E哀、板2-D gel疤电泳、扳Western瓣 Blotti昂ng巴、酶活性测定、岸受体分析等。胺组成罢：肮(啊5安0 extra岸ctions,扮 8 x 10败6罢 cells 半per ext拔raction傲)班CER, Cy靶tosol E暗xtracti唉on Reag矮ent隘，埃25胺ml; 瓣绊MER, Me颁mbrane 柏Extract敖ion

3、Rea捌gent胺，稗2.5捌 ml昂NER, Nu叭clear E瓣xtract唉ion Rea奥gent敖，唉50背 ml;捌Suspens唉ion Buf巴fer蔼，爱1把0 ml 矮储存氨：班4 C扮避光保存暗1摆年。拌收集细胞稗：绊准确计数，每一爸制备使用等量的按细胞数，将明显跋改善后续检测结叭果的一致性。每奥一制备约需要矮8 x 10鞍6版 1 x 柏10半7癌个细胞。扒贴壁细胞熬：翱PBS凹冲洗细胞皿，胰岸蛋白酶消化细胞俺。岸800 x g傲 哀离心笆5-10 mi氨n敖。弃上清，用摆PBS岸重悬洗涤细胞并笆再次离心收集细皑胞。注意：为避盎免胰蛋白酶在后吧续制备过程中降摆解蛋白质

4、，可用埃无酶细胞消化液矮(拌Non-enz吧yme Cel氨l Disas爱soci跋at巴ion Sol搬ution翱)八使贴壁培养的细笆胞与瓶皿分离。拌悬浮细胞：绊800 x g耙 俺离心哀5-10 mi板n鞍。弃上清。用半PBS爱重悬洗涤细胞并斑再次离心收集细碍胞。肮估计细胞沉淀压袄积皑PCV (pa埃cked ce澳ll volu俺me)艾：拔通常巴1 x 10俺6邦 傲个细胞离心后的艾PCV扳约为扳10肮-昂20 八l邦，澳1 x 10背7白 傲个细胞的按PCV傲约为百100扒 碍l拌。注意袄PCV爱大小与细胞数量佰有关，也与细胞班类型、大小、离懊心速度有关。制备步骤 癌制备全程在爸

5、4 C胺或冰水浴中进行皑。敖1.1 扳细胞匀浆裂解袄每耙1 x 10哀7颁个细胞或哎昂100叭 瓣l坝 半PCV叭的细胞沉淀加入懊500肮 爱l拌 CER熬试剂，震荡重悬阿。冰浴艾2 min熬。将细胞悬液转岸移到冰预冷的玻暗璃匀浆器内。冰阿上上下手动匀浆盎20-30般次。瓣注意：破碎细胞败是关键环节。用翱1-3 ml胺小容积玻璃匀浆哀器，须选用间隙艾严密的研杵，其肮特征是将研杵插拌入匀浆器套管后疤，可提起研杵而扮套管不会脱落。佰有效研磨是上下半推拉研磨而不是扒旋转。破碎效果熬与细胞类型有关伴。可在相差显微哀镜下检查，未裂霸解细胞应少于扮5%鞍。扮1.2 盎组织块匀浆裂解斑取艾250 mg叭哺乳

6、动物新鲜或熬-80 C傲冻存的组织块，癌勿剪碎为更小的拔块。放入拔冰预冷的玻璃匀挨浆器内。癌加入敖5稗00百 翱l坝 CER爱试剂。用埃研杵旋转将组织背块捣碎，爱上下手动预匀浆伴20扮次。冰浴搬10 min俺。然后上下手动暗预匀浆稗7蔼次。芭注意：与培养细伴胞特别是贴壁细叭胞相比，组织块暗中的细胞在匀浆袄时较易破碎，因岸而并非必须选用哀间隙严密的研杵矮。如果研杵与套拜管过于严密，组敖织匀浆困难，可按选用研杵与套管熬稍松的匀浆器。伴破碎效果与组织把细胞类型有关。柏可在相差显微镜拜下检查，未裂解唉细胞应少于柏5%哎。跋2. 傲取出捌啊500百 疤l盎裂解混合物，转俺移到皑1.5 ml氨离心管。扳8

7、埃00 g哀，败4 C傲离心百5 min斑。粗细胞核沉淀拜在管底，上清为扳胞膜跋-绊胞浆混合物。按叭照以下步骤首先胺制备膜与胞浆，把然后制备细胞核癌，或用两台离心案机同时制备。办3. 绊膜与胞浆制备：挨3.1. 芭将步骤伴2 般获得的上清液转隘移到新管，估计案上清液体积；碍3.2. 斑立即加入癌1/10斑积量的拔MER傲与上清液混合。澳冰浴爸5颁分钟；隘3.3. 澳最大转速哎14,000 哎rpm 4 阿C半离心八30跋分钟；拌3.4. 拔取出上清液转移岸到新管，此为胞爱浆组分；熬3.5. 凹沉淀为胞膜组分俺，含细胞膜和细柏胞内质膜的混合办物。再次瞬时离斑心除尽液体，用半100拔 笆l坝或背适

8、宜体积的拌Suspens版ion Buf矮fer癌或自备溶液重悬拔胞膜。笆4. 班细胞核制备：啊4.1. 颁加入扮500伴 拔l NER芭，振荡重悬半步骤奥2 巴获得的粗核。必拜要时按步骤安1.1懊匀浆胞核；昂4.2. 40拔00 g胺，矮4 C版离心霸5 min爸。弃上清；扳4.3. 肮再次加入背500佰 霸l NER拔洗涤暗胞核沉淀，并重捌复步骤斑4.2罢，离心后的上清八应清亮；哀4.4. 盎弃上清除尽液体傲。用鞍100爸 阿l艾或凹适宜体积扳Suspens坝ion Buf熬fer唉或自备溶液重悬百细胞核。说明背制备的胞浆组分拌或重悬于埃Suspens霸ion Buf靶fe隘的胞膜胞核组分

9、稗可进行癌Bradfor啊d瓣法、版Lowry佰法、伴BCA靶法蛋白定量、酶袄活性测定、受体啊分析。但进行免拔疫共沉淀、摆SDS-PAG百E昂、蔼2-D gel矮电泳、扮Western暗 Blot邦之前，需要笆1:1扳加入自备的挨2x 耙样品缓冲液稗(隘含适宜浓度的去皑垢剂如暗NP-40捌、鞍Triton 稗X-100邦、叭SDS)败。用户可不用坝Kit板中的岸Suspens哎ion Buf稗fer半，而直接用自行拔配制的样品缓冲哀液重悬胞核或胞艾浆沉淀，但这是暗要考虑自配缓冲拔液中是否有影响爸蛋白定量的因素佰。阿用瓣SDS-PAG八E Loadi艾ng 瓣缓冲液裂解细胞扮核后，爸DNA跋释放会使核裂解疤物十分粘稠，可昂95 C氨加热办5 min拌，高速振荡打断巴DNA邦，重复加热唉2-3半次。熬如果为凝胶阻滞胺实验隘(EMSA)挨目的提取核蛋白爸，建议用爱#P1200:摆 按核隘-矮胞浆蛋白制