DNA的复制与修复

1、遗传信息的 传递与表达DNA复制 RNA 转录蛋白质翻译逆向转录RNA复制中心法则基因（gene）：DNA上的功能单位，能够编码蛋白质或者RNA。基因表达（gene expression）：基因转录与翻译的过程。 第34章 DNA的复制和修复体细胞染色体有丝分裂一. DNA的复制高等生物染色体DNA原核生物基因组DNA原核生物染色体外DNA(质粒)病毒(一) DNA的半保留复制 定义：复制时，母链的双链DNA解开两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链。子代细胞的DNA双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则从新合成。由于碱基互补，两个子细胞的DNA双链，都和亲代母链DNA碱基

2、序列一致。这种复制方式称为半保留复制(semiconservative replication)。父代DNA子代DNA保留了一半父代DNA成份1、半保留复制的实验证据 1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli DNA，用密度梯度离心试验证明了DNA的复制是半保留复制。1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E. coli. 染色体DNA。 P408 图 34-3二、半保留复制的意义 DNA的半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性，经过许多代的复制，DNA多核苷酸链仍可保持完整，存在于后代而不被分解，这种稳定性体现了DNA遗传过程的相对

3、保守性。 遗传的保守性是相对的，而不是绝对的。自然界还 存在着普遍的变异现象。(二)复制的起点与单位基因组能独立进行复制的单位称为复制子（replicon)，每个复制子都含有控制复制的起点（origin)，可能还有终止复制的终点（terminus)。复制的方向大多是双向的（unidirectional)，形成两个复制叉分别向两侧进行复制，也有一些是单向的。origin双向复制与单向复制三复制的方式1.真核生物：双向，多复制子2.大肠杆菌：双向，单复制起点（型复制）3.病毒DNA：多种多样大肠杆菌染色体DNA1.型复制： 环状DNA的复制时，在复制起点处两条链解开，各自合成其互补链，在电子显微镜

4、下可以看到形希腊字母 形结构，这种复制方式就叫型复制DNA的单向复制1.滚环复制噬菌体X174DNA是环状单链分子。它在复制过程中首先形成共价闭环的双链分子(复制型)，然后其正链由内切酶在特定位置切开，游离出一个3-OH和一个5磷酸基末端。此5磷酸基末端在酶的作用下固着到细胞膜上。随后，在DNA聚合酶催化下， 以环状负链为模板，从正链的3-OH末端加入脱氧核苷酸，使链不断延长，通过滚动而合成出新的正链。2.D环复制双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才

5、开始复制。这表明复制起点是以一条链为模板起始合成DNA的一段序列；两条链的起点并不在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D环复制。DNA的单向复制(三) DNA复制的酶学 复制是酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种物质的共同参与： 底物： dNTP（ dATP、dGTP、dCTP、dTTP） DNA聚合酶：即依赖DNA的DNA聚合酶 模板：解开成单链的DNA母链 引物：RNA，提供 3-OH末端新链延伸方向：5 3 其它酶和蛋白质因子：解螺旋酶、拓朴异构酶、引物酶、DNA连接酶、单链结合蛋白 等 1、DNA的聚合反应 DNA复制的反应复制的化学反应方程式（dNMP）n + dNTP （d

6、NMP）n+1 + PPi2、DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA-pol）又称为DNA依赖的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase，DDDP）原核生物的DNA聚合酶：I、II、III；3种真核生物的DNA聚合酶：、；5种（1）原核生物的DNA 聚合酶 聚合酶 I 聚合酶II 聚合酶III 5 3聚合酶活性 + + + 3 5外切酶活性 + + + 5 3外切酶活性 + 相对分子量（103） 103 88 830 聚合速度(bp/min) 1000-1200 2400 15000-60000 持续合成能力 3-200 1500 大于50

7、0000 生物学功能 切除引物,修复 修复 复制大肠杆菌DNA聚合酶 I 、II 和 III的性质比较IIDNA聚合酶I：校读、修复Klenow 片段特异的蛋白酶DNA聚合酶III：新链延长核心酶DNA聚合酶损伤修复（2）真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶：延长随从链DNA聚合酶：相当于原核生物DNA-pol IIDNA聚合酶 ：延长领头链DNA聚合酶 ：位于线粒体内DNA聚合酶 ：起校读、修复、填补缺口的作用，相当于原核生物DNA-pol I 二者相当于原核生物的DNA-pol III（3）DNA聚合酶的核酸外切酶活性和复制的保真性1). 核酸外切酶活性：校读功能 DNA-pol , I：3

8、 5外切酶活性5 3聚合酶活性2). 复制的保真性DNA复制的保真性依赖三种机制： 遵守严格的碱基配对规律：A与T、G与C DNA-pol III 在复制延长中对碱基的选择功能 复制出错时DNA-pol I 有即时的校读功能3、DNA 连接酶（DNA ligase） 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成3 ，5磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链4.解螺旋酶 解螺旋酶通过水解ATP供能，解开双链DNA 解螺旋酶可沿模板随复制叉的伸展而移动 DnaB是解螺旋酶。DnaA蛋白辨认复制起始点，引起解链，在此基础上， DnaC蛋白辅助解螺旋酶结合于初步打开的双链，并

9、用其解螺旋酶活性打开双链。 拓扑异构酶I： 切断DNA双链中的一条链，使DNA解旋中不致打结，适当时再把切口封闭，反应不耗能拓扑异构酶II： 无ATP时，切断处于超螺旋状态的DNA分子双链某一部位，断端通过切口使超螺旋松弛 在利用ATP供能情况下，断端在拓扑酶催化下恢复连接松弛状态的DNA又进入负超螺旋状态5. 拓扑异构酶（I、II） 在复制过程中，DNA每复制10bp，复制叉前方的模板DNA 双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正超螺旋。6.单链结合蛋白（SSB） SSB的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 SSB与DNA的结合具有协同效应7、引物酶和引发体 引物酶（primas

10、e）： 复制是在一段RNA引物提供3 OH末端的基础上进行的，催化引物合成的是一种RNA聚合酶，称为引物酶。它与催化转录过程的RNA聚合酶不同。引物酶可合成6-10个碱基的RNA引物。DNA复制为什么要用引物？（而RNA聚合酶不需要引物？）从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的53 校对功能难发挥作用。 P.419 三种酶催化生成磷酸二酯键的比较 提供核糖3-OH 结果DNA聚合酶 引物或 （dNMP）n+1 延长中的新链连接酶 复制中不连续的 不连续连续链 两条单链 连接双链DNA的单链缺口拓扑酶 切断、整理

11、后 改变拓扑状态 的两链第二部分 DNA生物合成过程 DNA复制分为三个阶段 一、复制的起始 二、复制的延伸 三、复制的终止一、复制的起始 复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示。 原核生物每个DNA分子只有一个复制起始点，真核生物DNA分子有多个复制起始点。 打开双链 生成引发体3.ATTAGGTGT.TTATACACA.5335.AATAGGTTT.TTATCCACA.33555（一）打开双链防止单链复合3.DNA结合蛋白与单链结合并向前移动DNA结合蛋白起点提问：DNA结合蛋白的作用？GCAT解螺旋酶（

12、二）引发体的生成 复制过程需要引物，引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。 在解链的基础上，形成了DnaB、DnaC蛋白与DNA的起始复制区域相结合的复合体，此复合体再与引物酶结合成的复合体结构称为引发体。二、复制的延长 dNTP按碱基互补配对原则逐个加入而延长DNA新链，其化学本质是生成3, 5-磷酸二酯键。催化此反应的酶，在原核生物为DNA-pol III，真核生物为DNA-pol 和。新链延伸方向：5 3新链延伸方向：5 3 复制开始时，双链打开，形成一个复制叉。两条单链分别做模板，各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是53，另一条链的走向是35，但生物体内DNA聚合酶只能

13、催化DNA从53方向的合成。 顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链。另一条子链复制的方向与解链方向相反，复制是不连续的，称为滞后链。这种复制方式称为半不连续复制。复制的半不连续性 随从链上不连续复制的DNA片段称为冈崎片段。每一个冈崎片段5-端都带有一个RNA引物。半保留复制结果半不连续复制过程半不连续复制 随从链复制时必须等待模板链解开足够长度时，才能从53合成引物后开始复制。延伸时，又要等待下一段暴露出足够长的模板，才能再次合成引物而延长。岗崎片段三、复制的终止 原核生物的环状DNA多采用双向复制的方式。复制的终止是双向复制的两子链在复制终止点的汇合。 复制中的不连

14、续片段需连接成连续的子链。这一过程需先由RNA酶水解引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化dNTP逐一自5向3端聚合而填补。最后，两不连续片段相邻的5-P和3-OH还有一个缺口，则由DNA连接酶加以连接。真核生物的端粒和端粒酶 真核生物染色体DNA采取线性复制方式。子链5-端的一段RNA引物被水解后，留下的空隙由端粒的端粒酶爬行式复制而不缩短。端粒（telomere）：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构，富含GxTy的正向重复序列。端粒DNA受特殊蛋白质保护，不被核酸酶水解。端粒酶（telomerase）：保护端粒的特殊蛋白质，是一种核糖核蛋白，是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质构成，能识

15、别和结合端粒序列。其中RNA大约有150个核苷酸，富含CxAy，正好与端粒序列GxTy的单链呈杂交结合状态。模板二 DNA损伤(突变)与修复突变的因素突变的类型DNA损伤的修复如经DNA修复后有缺陷，DNA就会发生突变发展成癌细胞化学因素：碱基类似物、 碱基的修饰剂（羟胺类、亚硝酸盐、 烷 化剂） 嵌入染料一、突变的因素物理因素 ：紫外线1碱基类似物（base analog）与DNA正常碱基结构类似的化合物，也能在DNA复制时取代正常碱基基掺入井与互补链上碱基配对。但是这些类似物易发生互变异构(tautomerization)，在复制时改变配对的碱基，于是引起碱基对的置换。 5溴尿嘧啶(BU)

16、是胸腺嘧啶的类似物，在通常情况下它以酮式结构存在，能与腺嘌吟配对；但它有时以烯醇式结构存在，与鸟嘌呤配对。胸腺嘧啶也有酮式和烯醇式互变异构现象，但其烯醇式发生率极低。而5溴尿嘧啶中由于溴原子负电性很强，其烯醇式发生率要高得多，因此显著提高了诱变的能力。结果使AT对转变为GC对；2-氨基嘌呤(AP)是腺嘌呤的类似物，正常状态下与胸腺嘧啶配对，但以罕见的亚氨基状态存在时却与配对胞嘧啶。因此，它能引起AT对转换为GC对 2，碱基的修饰剂(base modifier)某些化学诱变剂通过对DNA碱基的修饰作用，而改变其配对性质。例如：亚硝酸能脱去碱基上的氨基。腺嘌呤脱氨后成为次黄嘌呤，它与胞嘧啶配对而不

17、是与原来的胸腺嘧啶配对。胞嘧啶脱氨后成为尿嘧啶，它成为与腺嘌呤配对。羟胺与碱基作用十分特异，它只与胞嘧啶作用，生成4-羟胺胞嘧啶(HC)，而与腺嘌呤配对，结果GC对变为AT对。 烷化剂是极强的化学诱变剂，最常见的是鸟嘌呤上第7位氮原子的烷基化，引起分子电荷分布的变化而改变碱基配对性质， 3 嵌入染料一些扁平的稠环分子，例如吖啶橙(acridine)、原黄素(proflavine)、溴化乙锭(ethidium bromide)等染料，可以插入到DNA的碱基对之间，故称为嵌入染料。这些扁平分子插入DNA后将碱基对间的距离撑大约一倍，正好占据了一个碱基对的位置。嵌入染料插入碱基重复位点处可造成两条链

18、错位。在DNA复制时，新合成的链或者增加核苷酸插入，或者使核苷酸缺失，结果造成移码突变。 二、突变的类型 点突变（point mutation） 缺失（deletion） 插入（insertion ） 重排（rearrangement）点突变（错配）缺失移框突变：指缺失或插入（核苷酸）的突变，引起三联密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出一级结构完全不同的另一种蛋白质。重排 DNA分子内发生较大的交换。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。三、损伤的修复 光修复（photoreactivation) 切除修复(excisi

19、on repair) 重组修复(recombination repair) 诱导修复（induction repair)1.光复活高度专一的修复方式，它只作用于紫外线引起的DNA嘧啶二聚体DNA损伤的修复紫外光可见光激活该酶只有高等哺乳动物该功能退化掉了。例 对细菌紫外诱变或杀灭时尽量保持暗环境。光复活酶结合于损伤部位切除修复：细胞内最重要的修复机制。通过切除损伤部位，剩下的空隙由DNA-pol I催化dNTP聚合而填补，最后由DNA连接酶连接缺口。切除损伤在原核生物需Uvr蛋白类，真核生物需AP蛋白类。重组修复：重组修复是先复制再修复。这种情况出现在 DNA损伤面积较大，来不及修复就进行复制

20、。其损伤部位失去模板作用，造成子链上缺口出现。此时，可通过链间的交换，从完整母链将相应核苷酸序列片段移到子链填补该缺口。这时造成母链的缺口，再通过DNA-pol I、DNA连接酶进行修复。这种修复的不足之处在于原损伤部位仍然存在，但随着多次复制，损伤链所占比例越来越少。诱导修复（SOS修复）： SOS是国际海难信号。SOS修复是指DNA损伤严重，细胞处在危急状态下的一种修复方式。此种情况下，DNA单链缺口很多，由此诱发出一系列极复杂的反应以增强其修补能力。除参与修复的酶系统外，还有重组蛋白RecA和调控蛋白LexA等参与。这种修复反应特异性较低，对DNA的碱基识别能力差。通过SOS修复，细胞可

21、存活，但DNA保留的错误较多，会引起长期广泛的突变，往往导致细胞恶变。一、DNA损伤与肿瘤二、DNA损伤修复缺陷导致人类的遗传疾病A、DNA修复缺陷导致的人类遗传疾病B、细胞对DNA损伤应答缺陷导致的遗传病DNA损伤与肿瘤日本广岛原子弹爆炸DNA损伤与肿瘤切尔诺贝利核电站大爆炸世界上最严重的核事故8吨多强辐射物泄漏 污染区域超过20万平方公里受害者约700万人 消除影响需100多年 切尔诺贝利核电站泄漏 到现在，参加救援工作的83.4万人中，已有5.5万人丧生，7万人成为残疾人，30多万人受放射伤害死去。乌克兰共有250万人因切尔诺贝利核事故而身患各种疾病，其中包括47.3万儿童。在乌克兰的核受害者中最常见的是甲状腺疾病、造血系统障碍疾病、神经系统疾病以及恶性肿瘤等。离核电站仅公里的普里皮亚季镇，年来成为无人居住的“死城”。 切尔诺贝利核电站公里以内被划为隔离区，严格限制进入，出入的人必须持有有效证件。 DNA损伤DNA修复异常基因突变肿瘤发生 DNA损伤可以通过基因易位、重排、基因扩增、点突变等机制导致原癌基因的激活，也可以通过基因丢失、基因点突变使抑癌基因失活，癌基因、抑癌基因的失衡是细胞恶变的重要机制。人类遗传性非息肉病性结肠癌（HNPCC）hMSH2、hMLH1、hpMS1和hpMS2四个错配修复基因