酶学与酶工程总结

1、 Lecture 1酶学与酶工程酶的概念：酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特 殊蛋白质，是一类生物催化剂。酶的分类（6类）、组成、结构特点？和作用机制？-Xffl*W -因定化布，车t邪的 沌咔推怖帕！It* I I.占良的断组成:单体酶、寡聚酶、多酶复合体Note: 一个酶蛋白可有多种催化活性，相当于多个酶（关注原核和真核生物的差别） 除水解酶和连接酶外，其他酶在反应时都需要特定的辅酶。金属在酶催化中的作用：稳定酶构象、参与酶的催化作用（如激活底物）电子传递 体酶作为催化剂的显著特点：强大的催化能力：加快反应速度可高达1017倍;没有副反应；高度的专一性：各

2、种酶都有专一性，但专一程度的严格性上有所差别； 可调节性；同工酶的概念:同一种属中由不同基因或（复）等位基因编码的多肽链所组成的 单体、纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称同工酶。 同一基因生成的不同mRNA所翻译出来的酶蛋白也列入同工酶的范畴。酶蛋白合成后经不同类型的共价修饰（如糖基化等）而造成的多种酶分子形式，严 格来说不属于同工酶而称为synzyme，但也有人称其为次生性同工酶（secondary isozyme）。不同种属中催化相同反应的酶称为xenozyme，也不属于同工酶。酶的活性中心指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异

3、结合并将底物转化为产物必需基团（essential group）:酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密 切相关的基团。活性中心内的必需基团：结合基团（与底物相结合）和催化基团（催化底物转变成 产物）活性中心外的必需基团：维持酶活性中心应有的空间构象所必需；构成酶活性中心的常见基团:His的咪唑基、Ser的一OH、Cys的一SH、G山的y-COOH。酶的作用机制酶活力的调节酶的应用食品加工方面：生物技术在食品工业中应用的代表就是酶的应用，目前已经有几十 种酶成功用于食品工业。如葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果 蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等。常用的酶制剂主

4、要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、 纤维素酶葡萄糖氧化酶等。酶在轻工业方面的应用：用酶进行原料处理（发酵原料、淀粉原料、纤维素原料、 含戊聚糖的植物原料的处理、纺织原料、造纸原料的制浆、生丝的脱胶处理、羊毛 的除垢），用酶生产各种产品（L-氨基酸、核苷酸、酱油或豆酱、制革），用酶增强 产品的使用效果（加酶洗涤剂；加酶牙膏、牙粉和嗽口水）酶在医学中的应用：主要的医药用酶、用酶进行疾病的诊断、用酶治疗各种疾病、 用酶制造各种药物酶与食品质量安全酶制剂作为食品添加剂进入食品的潜在危害酶催化有毒物质的产生酶作用导致食品中营养组分的损失潜在的产毒素性潜在的致病性对策：安全菌株，

5、体外基因毒理学测试，酶制剂的安全评价，酶制剂来源安全性的 评估标准 Lecture 2基因工程的酶学基础 核酶（Ribozyme）：概念：具有生物催化功能的RNA。看课件基因工程的酶学基础 基因克隆表达的过程基因克隆常用的酶，有什么应用，注意事项（补充后两者）重组DMA技术中常用的工具酶工具酶功能1限制性杨酸内切酶识别特异序列，功割DFW连接酶催化DNA中相邻的5,潺酸基枷羟垦末端之间形成城酸二酯 建，使DNfc切口封合我使两个CNA分子或片段莲接舍成双链cDftt分子或片段连接缺平移制作高比活探钎0帙序列分柝填补3,末端Kleriow) 段又名DNA聚合酶1大片既 具有完越DK便合酶I的5J

6、3,聚合.外切活札而无外切活性.常用于藏第二链 合成，双遂DMA 3,末端标倒反转衲合成顽A替代DK硬合酶1进行填补.标记或Dh梏列分析多聚接昔酸微酶催化多聚核通静建真未髭诫的 或畚记痴针末端转移醉在3琏葺未端进行同质多聚物加尾碑性磷酸酶切诊末端磷酸基 Lecture 3酶促反应酶促反应的特点与机理：极高的效率（降低反应的活化能），特异性和可调节性特异性：一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反 应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。绝对特异性（absolute specificity）：酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构

7、的产物相对特异性（relative specificity）：酶作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性（stereo specificity）：酶仅作用于立体异构体中的一种。机理：酶-底物复合物的形成与诱导契合假说（酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合）可调节性：对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等两个假说：锁钥假说，诱导契合假说酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速度的影响影响酶促反应的因素，Km值的意义，测定（双倒数作图法）影响因素包括有：酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。（具体见课件）Km的意义和作用：

8、Km值等于酶促反应的初速度为Vmax的一半时所需的底物浓度。Km值近似等于ES的解离常数，1/ Km近似地表示酶对底物亲和力的大小。Km是酶的特征性常数，在一定程度上代表酶的催化效率。当、温度和离子强度恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，而与酶的浓度无关。一种酶能催化几种底物时就有不同的Km，其中Km最小的底物一般认为是该酶的天然底物或最适底物。当Km已知时，可求得任何底物浓度下酶活性部位被底物分子饱和的分数（FES）。分辨同工酶：测定几个同工酶对同一底物的Km，可估计这组同工酶是原级同工酶还 是次生性同工酶，前者的Km常有差异，后者的则比较接近或相同。探讨代谢规律：肌肉中的A型醛缩酶，对果糖

9、-1,6-二磷酸的Km为3mol/L，对3- 磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的Km分别为1mmol/L和2 mmol/L，可知其在体内主要 催化糖酵解而难于参与糖异生。有助于寻找代谢的限速步骤：如酶1，2, 3分别催化A B C D三步 连续反应，三个酶的Km分别为10 mmol/L， 1 mmol/L， 0.1 mmol/L，而细胞内A， B，C的浓度相同，可推知酶1催化的A B为限速反应。指导生化实验：利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可根据米式公式的积分式来 计算工具酶的用量。工具酶的Km越大，所需加入的酶量也越大。KmKm+SVm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。有哪些抑制类型

10、，与Km之间的关系不可逆性抑制：抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透 析、超滤等方法予以除去。碘乙酸（ICH2COOH）是一种烷化剂，可使巯基烷化。有机磷化 合物（丝氨酸的-OH磷酯化）、重金属离子及砷化合物可逆性抑制：抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失； 抑制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制：抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍 酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。（丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂/ 磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制）.抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及0；动力学特点:Vmax不

11、变，表观Km个。 可通过增加底物浓度而使整个反应平衡向生成产物的方向移动，因而能削弱或解除 这种抑制作用。非竞争性抑制：抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞 争关系。抑制剂并非结合于活性中心的底物结合位点，而是此位点以外的基团，如催化基团 等。抑制剂与活性中心结合后也不引起底物结合的立体障碍。如别嘌吟醇竞争性抑制黄嘌吟氧化酶，其氧化产物别黄嘌吟非竞争性抑制黄嘌吟氧 化酶。非竞争性抑制的特点S和E或ES都能结合，两者结合的亲和力相等也能和E或ES结合，两者的亲和 力相等。S和I与酶的结合既不互相排斥，也不互相促进抑制程度取决于I;动力学特点：Vmax4,表观Km不变。这种抑制

12、作用不能用增加底物浓度的方法来消 除。反竞争性抑制：抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。抑制剂只与ES结合;抑制程度取决与I及S；动力学特点：Vmax，表观Km“ 混合性抑制作用：S和E或EI都能结合，I也能和E或ES结合，但亲和力都不相 等。S和I对E的结合互有影响。相当于纯非竞争性和部分竞争性抑制作用的混合 系统。表7-5抑制类型及其特标的比较炎里公式rnax.虬,.斜率无抑制剂5：一，）廿门口隹.号Am+lSJJ意争性枷刑ViwdNKeII +l：JiMS不变竟个竹抑制制略a饵|Il *|IJ KiKKm + |S8诚1、不业? - h. r.V 171?1祐*|Xs、

13、 , |l|.诚1减小f也酶的调剂：酶原调节，变构调节，共价调节酶原（zymogen）:有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶 原。例子：胰蛋白酶原、血液凝固的级联放大作用、胃蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原 酶原的激活:在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。酶原|在特定条件下一个或几个特定的肽键断裂，水解 掉一个或几个短肽分子构象发生改变形成或暴揖出酶的活性中心酶原激活的机理形成或暴揖出酶的活性中心酶原激活的机理变构调节：一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。变构酶的特点：1、通常具有四级结构，存

14、在协同效应；2、含有催化亚基和调节亚基（或催 化部位和调节部位）。3、S-v关系曲线为S形。一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，这种效应为协同效 应。别构酶举例：天冬氨酸转氨甲酰酶，简称ATCase共价修饰:在其他酶的催化下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆 的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。磷酸化与脱磷酸化（最常见）/乙酰化和脱乙酰化/甲基化和脱甲基化/腺苷化和脱腺苷化/SH与一SS互变特点：受共价修饰的酶存在有（高）活性和无（低）活性两种形式；具有瀑布效应（级联效 应）；是体内经济、有效的快速调节方式。 Lecture 4酶的分离纯

15、化发酵液的预处理细胞的破碎方法酶的提取分离方法酶的浓缩结晶纯化方案的设计与评价 Lecture 5固定化酶与固定化细胞为什么要固定化酶，酶固定化的优缺点 固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后 的酶可以回收重复使用。为什么要固定化酶：酶的优点和缺点优点：高催化效率；高专一性。缺点：对环境十分敏感；易失活；不能回收。固定化生物催化剂的优点底物产物分开；能回收，可反复使用；易于连续化、自动化酶固定化的优缺点优点：酶固定化的方法（详见课件）-五炫酣I跳-J固理化酶1催饷i酬-化学信侦的酸分水平上改母的腾特性物理吸附法离子钻合法包理法合法文联法制备易易洛爵合力中强强爵活力

16、高高高中中底略专-性无变化无变北无斐战有蔓祀有变祀再生可能可能不可不可能不可能固定化费用低低中中高酶固定化的性质大多数固定化酶活性下降；提高了稳定性；最适温度也随之提高，不变或下降；pH 和pH-活性曲线常常发生偏移（微环境表面电荷性质的影响）外变化（高级结构变 化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，又受溶液中离子强度的影响） 固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质。酶：生物化学性质；动力学参数载体：化学特征；机械性质固定化酶：固定化方法；稳定性等细胞的固定化概念：将细胞约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被 反复或连续使用的活力。固定在载体上并在一定的空间范围

17、内进行生命活动的细胞 称为固定化细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。优点：保持了细胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定；保持了细胞内原有 的多酶系统，适于多步催化的反应；无需辅酶再生；固定化增殖细胞发酵具有显著 优越性。缺点：细胞内有多种酶，可能有副反应；细胞膜等存在扩散限制作用；载体形成的 孔隙大小影响高分子底物的通透性。固定化细胞的分类，制备方法分类方式固定化细胞细胞类型麻生物，植物，动物生理状恋死细胞：完整细胞，细胞捽片细胞 器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥慵 细胞1.化学法（共价交联）2.包埋法3.吸附法固定化酶与固定化细胞的应用：生物化学与分子生物学基础研究/亲和分离系

18、统/药 物控释载体/在食品、制药等轻工、化工领域/生物传感器生物传感器：又称生物活性物质修饰的传感器 Lecture 6酶的修饰（1）酶反应器的概念，类型概念：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置应器搅拌罐型Y注续流搅拌桶反应器。固定扇型（填充床反应器）流化底反应器膜式反应器鼓泡塔型酶的稳定性和稳定化酶（蛋白质）的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。要保 持其生物活力，必须保持其空间结构。稳定化指的是熵（Entropy）性质：由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的 熵急剧降低酶的化学修饰：化学酶工程（详见课件从开始）改变酶特性有两种主要的方法：1）通过分子修饰的方法

19、来改变已分离出来的天然酶的活性（化学酶工程）。2）通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的（生物酶工程）。化学修饰定义：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人 工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变 酶分子的酶学性质的技术。酶化学修饰的原理、酶化学修饰的基本要求和条件修饰的类型（最常见大分子修饰剂）化学修饰分为可溶性大分子修饰酶和小分子修饰酶：可溶性大分子修饰酶：PEG修 饰的人血红蛋白最常用的修饰剂一一PEG类修饰剂聚乙二醇（polyethyleneglycol, PEG）是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在 体内无毒

20、性、无残留。其生物相容性已通过美国食品和药物管理局（FDA）认证。通常没有免疫原性和毒性，不会破坏生物分子的活性，并可消除酶的抗原性，使其末 端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。PEG分子量范围很宽，适合用作修饰剂或修饰剂出发原料的PEG的相对分子质量一 般为50020000。PEG既溶于水，又溶于绝大多数有机溶剂，但不溶于乙醚、脂肪烃。 Lecture 7酶的修饰（2）-酶的化学修饰：化学酶工程修饰的设计（见课件部分）-酶的分子修饰：生物酶工程将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改 变酶的某些特性和功能的方法。生物酶工程主要包括：（1）用基

21、因工程技术大量生产酶（克隆酶）；（2）修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；（3）从蛋白质或基因水平上设计，合成酶杂合体或自然界不曾有的酶（杂合酶）。酶分子的改造：基于序列的合理化设计方案：化学修饰，定点突变。利用基因的可操作性，模拟自然界的演化过程的非合理化设计方案，如定向进化。- 修饰的过程和原理-酶的定向进化（方法及原理）定义：所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它 不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进 化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的 突变酶。原理：定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于