报告往届定稿

1、摘 要第一章 首先对毛细管电泳基本原理、检测方法以及应用做了简单概述，并详细介绍了目前毛细管电泳的发展现状，对毛细管电泳电化学分离检测的方法做了介绍，重点对毛细管电泳电化学检测在场放大富集方面的应用研究的方法做了说明介绍。第二章 本章以的微盘电极作为工作电极，采用毛细管电泳-电化学检测的方法实现了多巴胺、色氨酸、酪氨酸、尿酸、半胱氨酸、组胺和抗坏血酸多种物质的分离。重点研究了缓冲液的值大小、所需缓冲液浓度的大小、所加电压等分离条件对分离效果的影响。最终确定分离的最佳条件为：浓度为 40mmolL-1 的NaH2PO4 - Na2HPO4 缓冲液，缓冲液的值为8.0，分离电压为10 kV，检测电

2、势为 1.2 V（vs.Ag/AgCl），进样时间为 5 s，在此条件下，实现了以上各种物质的分离，重复测定得到多巴胺的回收率为 93 102 %。第三章 本章同样采用毛细管电泳-电化学检测方法，对酱油中所含的色氨酸进行分析，首先确定了色氨酸标准样品的最佳检测条件，实验最佳条件为： 值为 9.5、浓度为 5.00 10-2 molL-1 的硼砂- NaOH 缓冲液，进样 10 kV10 s，分离电压为 18 kV，检测电势为 1.2 V (vs. Ag/AgCl)；在此条件下利得到色氨酸的线性范围分别为 7.9 10-6 2.5 10-4 molL-1，最低检测限为(S/N = 3) 为 2.

3、0 10-7molL-1。根据标准曲线得到样品中所含色氨酸的浓度为 3.0 mgL-1，通过多次重复测定得到该物质的回收率为 97106 %。第四章本章采用毛细管电泳-电化学检测的方法，运用了场放大的技术实现了色氨酸和半胱氨酸的分离检测，通过对各种实验条件的优化选择，确定了实验的最佳条件：8.0，40 mmolL-1 的硼砂-硼酸缓冲溶液，进样 12 kV10 s，10-8分离电压为 15 kV，检测电势为 1.2 V (vs. Ag/AgCl)。在此条件下对 5.00 molL-1 及 5.00 10-5 molL-1 的色氨酸和半胱氨酸进行检测，最终得到色氨酸及半胱氨酸的放大倍数分别为 1

4、.7510 3 、1.9210 3 倍。第五章 本章介绍对提取的大鼠腹腔肥大细胞的检测，通过利用毛细管电泳-电化学检测实现了大鼠腹腔肥大细胞内谷氨酸的检测。主要方法是采用了 CZE 柱上衍生的技术，实现了谷氨酸的检测。确定了检测的最佳实验条件为：值为9.5、浓度为 2.00 10-2 molL-1 的硼砂-NaOH 缓冲液，进样 10 kV10 s，分离电压为 15 kV，检测电势为 1.2 V (vs. Ag/AgCl)，在此条件下得到了该物质的标准曲I线，以及最低检测限(S/N = 3)为 4.0 10-7 molL-1。：毛细管电泳；氨基酸；场放大；电化学检测IICAPILLARY EL

5、ECTROORESIS FIELDLIFICATION EFFECT INELECTROCHEMICAL DETERMINGAVARIETY OF AMINO ACIDS AND THEAPICATION OF BIOACTIVESUBSTANABSTRACTIn the chapter one,of all, the basic princi e, detection method andap ication of capillary electrooresis（CE）wereroduced brifly. Focus on thepresent situation of capillary

6、 electrooresis with respect to do a detailedysis, theent ofseparation of capillary electro capillary electrooresis presentroduced.In the chapter two, we useoresis was presented focused on enrilification electrochemical detection methods wasself-made micro disk electrod as work electrode,capillary el

7、ectrooresis-electrochemical detection method was adopted to realize thedopamine, tryptoan, tyrosine, uric acid, cysteine, histamine and ascorbic acidseparation of a variety of material. Focus on theof the buffer size, the size of thebuffer concentration required, such as ap ied voltage separation co

8、nditions on theseparation effect. Ultimay determine the best conditions of separation are asfollows: concentration of buffer was 40 mmolL-1 NaH2PO4 - Na2HPO4, buffervalue of 8.0, separation voltage of 10 kV, detection potential of 1.2 V (vs), sletime is 5 s, under this condition, realizes the separa

9、tion of the above substandopamine recovery after repeated measurements was 93 102 %.TheIn the chapter three, the capillary electrooresis - electrochemical detectionmethods,yze the tryptoan in soy sauce contains,of all determine thetryptoan standard sles of the best testing conditions, the optimum co

10、nditions:10-2molL-1 borax - NaOH buffer, sof concentration was 9.5, 5.00 leinjection of 10 kV 10 s, separation voltage of 18 kV, detection potential of 1.2 V (vs.IIIAg/AgCl); Tryptoan in this condition, the linear range of 7.9 10-6 - 2.5 10-4molL-1 , the lowest detection limit (S/N = 3) for 2.0 10-7

11、 molL-1. According to theryptoan concentration is 3.0 mgL -1,thestandard curve to get the sles contarecovery of the substance was 97 106 % by repeating measured.In the chapter four, with capillary electrooresis - electrochemical detectionmethod using the fieldlification technology to realize the sep

12、aration oftryptoan and homocysteine detection, through the optimization of variousexperimental conditions, determined the optimum conditions of experiment,8.0,the tendency for 40 mmolL-1 borax - boric acid buffer solution, and the injection of12 kV for 10 s , separation voltage of 15 kV, detection p

13、otential of 1.2 V (vs. Ag/AgCl). Under these conditions, 5.0 10-8 and 5.0 10-5 molL-1 tryptoan andcysteine, was detected the resultinglification of tryptoan and cysteine .Themulti es respectively.1.75 10 3 、1.9210 3 times.In the Chapter five, this chapter extracted rat peritoneal mast cells detectio

14、n, through the use of capillary electro oresis - electrochemical detection has realized the glutamic acid in rat peritoneal mast cell detection. The main method is to adopt the CZE column on derivative technology, im ements the glutamic acid detection.Determines the optimum experimental conditions f

15、or detection, and the concentrationoncentration of 2.00 10-2 molL-1 borax - NaOH buffer, andle 10 kV 10 s, separation voltage of 15 kV, detection potentialof theof 9.5the injection of sof 1.2 V (vs. Ag/AgCl), under this condition we get the standard curve of thesubstance, and the limit of detection

16、was 4.0 10-7 molL-1.KEY WORDS: Capillary electrooresis, FdElectrochemicallification Effect, Amino acids ,IV目录第一章 文献综述11.1 毛细管电泳的基本原理和发展状况11.1.11.1.21.1.31.1.4毛细管电泳的发展历程1毛细管电泳的进样技术1毛细管电泳的检测技术2毛细管电泳应用研究进展3单细胞分析3单细胞进样4细胞溶膜5细胞衍生6单细胞分析应用7样品堆积场放大效应7场放大富集7场放大技术的发展趋势9展望9参考文献10第二章 毛细管电泳柱端分离检测多巴胺、尿酸和抗坏血酸等多种物质

17、192.1 引言192.2实验部分192.2.12.2.22.2.3实验仪器19材料与试剂20实验方法202.3.22结果与2.3.1 毛细管电泳柱端检测 DA,UA 和 AA、HA、Cys、Trp、Tyr 七种物质的分离条件22线性范围、检测限和重现性24人血红细胞溶膜液的检测25结论252.4参考文献26第三章 毛细管电泳-电化学方法检测酱油中的色氨酸29V3.13.2引言29实验部分303.2.13.2.23.2.3实验仪器30材料与试剂30实验方法303.3结果与.31检测色氨酸实验条件的选择31样品的电化学检测33线性范围和重现性34回收率测定35结论353.4参考文献36第四章 毛

18、细管电泳场放大检测色氨酸和半胱氨酸394.1 引言394.2 实验部分394.2.14.2.24.2.3仪器39材料与试剂39场放大堆积方法394.3 结果与.404.3.1 缓冲液种类404.3.2 缓冲液值40缓冲液浓度41检测电势42进水时间42分离电压43场放大检测色氨酸和半胱氨酸434.4 结论44参考文献45第五章 毛细管电泳电化学检测单个大鼠腹腔肥大细胞中的谷氨酸 475.1 引言47实验方法475.2.1 仪器47材料与试剂48实验方法48VI5.3 结果与.50谷氨酸衍生反应的最佳条件50谷氨酸检测的线性范围53电化学检测谷氨酸54回收率测定555.4 结论55参考文献56结

19、 论58符号与缩写59谢60致目录61攻读学位期间已和待的相关学术独创性. 62VII第一章 文献综述1.1 毛细管电泳的基本原理和发展状况毛细管电泳(capillary electrooresi，CE)是 20 世纪八十年代初逐步发展起来的一种新型的分离分析技术，是传统电泳技术和当代微柱分离相结合而产生的，是在高效液相色谱(HC)1产生后，分析科学研究领域的又一次革新。毛细管电泳法泛指以高压电场作为驱动力，毛细管作为分离通道，根据样品中所含各个组分间淌度和分配行为上的差异来实现分离分析的一种液相分离技术。毛细管电泳(CE或HPCE)是一种传统电泳技术与当代微柱分离相结合的新型分离技术。在过去

20、的20多年里毛细管电泳已经成为一种重要的分析工具因为它具特点2有强大的分离能力，高效，分析时间短，样品和试剂消耗量最。使其成为非常有效的分离技术，广泛用于糖类、蛋白质、核酸等多种物质的分离。1.1.1 毛细管电泳的发展历程毛细管电泳又被称作高效毛细管电泳3-6，是近几年来发展起来的最快的分析方法之一。1981 年 Jenson 和 Lukacs7-9 首次提出在 75 微米内径内用高电压进行分离，创立了所谓的现代毛细管电泳。1984 年 Terabe 等共同建立了一种胶束毛细管电动力学色谱10-14。1987 年 Cao15等建立了毛细管等电聚焦，Cohen 和 Karger 共同提出了毛细管

21、凝胶电泳。1988出现了首批毛细管电泳商品仪器。在短短的几年内，由于 CE 符合以生物工程为主的生命科学中各个领域对蛋白质(酶，抗体)、核苷酸甚至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析检测要求，得到了较快的发展。分离分析类型16-20：毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrooresis，CZE） 21,22；毛细管等速电泳（capillary chromatogray，CITP）23；毛细管胶束电动色谱（miceller electrokinetic capillary chromatogray，MECC）24；毛细管凝胶电泳（capillary gelelectrooresis，

22、CGE）25；毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）26。毛细管电泳的进样技术电动进样毛细管干净以后，用微注射器注入缓冲液，然后将其两端分别浸在两个盛有缓冲液的储瓶中。用电迁移法进行注样时，将盛有样品液的储瓶替代一端的缓冲液储瓶，高压电通过样液瓶引入，电路按照一定的时间周期接通，通常是几秒钟接通一次，以使进入毛细管的样品区带变窄。之后断电，并用缓冲储瓶1代替样液瓶，再通高压电，使电泳过程开始。电动进样对于毛细管内所填充的介质没有特别的要求，属普适性的法，可实现操作自动化，也是商品仪器必用的一种进样方法。但是电动进样对离子组分有进样偏向，即离子速

23、度大者多进，小者会少进甚至不进，这显然会降低分析方法的准确性、可靠性。1.1.2.2 压力进样压力进样又叫进样，它要求毛细管中的填充介质必须具有性，例如溶液等。当将毛细管的两端放于不同的压力环境中时，管中的溶液便能，将试样带入。利用压缩空气（如钢瓶气）可以完成正压进样，并且能够与毛细管系统一起共用，多用于商品仪器。负压进样的控制设计需要特别的精密，因为容易泄露等多种原因会引起不重复进样。正、负压进样都需要有好的密封技术。压力进样不存在偏向问题，但该方法选择性较差，样品和其背景都一起被引进毛细管管中，对后续分离可能会产生影响。1.1.2.3 扩散进样利用浓度差扩散的原理同样可以将样品分子引入毛细

24、管中。当插进一样品溶液的时侯，样品分子会向管内扩散因管口接口存在浓差。毛细管扩散进样还具有双向性：当样品分子进入毛细管的时侯，区带中的背景物质也会向管外扩散。因此可以得到畸变程度小(和背景差别很小)的初始区带，能抑制背景干扰从而提高分离效率。扩散也与电迁移方向和速率无关，可抑制进样偏向，提高定量定性的可靠性。1.1.3 毛细管电泳的检测技术检测技术 检测器是单细胞 CE 分析方法的关键。检测器种类很多，但能应用在单细胞多种组分分离和定量检测的有电化学检测27，激光诱导荧光检测28-37，紫外检测38，放射化学检测39，质谱检测40,411.1.3.1 电化学法和免疫分析法等42。Ewing 等

25、研究小组首次将毛细管电泳过系统性的研究工作。他们在采用全细胞进样检测应用于单细胞的分析，而且经方法检测分析单个多巴胺神经细胞时，发现溶解细胞所需要的时间会变短造成迁移时间不相同的两个多巴胺峰，当在细胞培养液中加入培育后再进样，则只有一个峰。据此推测他们是来自不同的多巴胺的泡囊。Ewing43等人也通过研究证实了上述推测44。1.1.3.2 激光诱导荧光法激光诱导荧光具有非常高的灵敏度45,46，检出限已经达到分子级水平。CE与该法结合，兼具有高分辨率和高灵敏度的优点。激光诱导荧光法又包括天然荧光法，间接荧光法，化学标记荧光法，和催化荧光法。Xue47等最早将催化荧光2检测法应用于单个血红细胞中

26、乳酸脱氢酶的活性分析。在柱微型免疫检测Kong48等提出一种 CE 的在柱微型免疫检测方法，电泳毛细管内填充与抗体共价键合的胶体颗粒，在高压电场的作用下胶体颗粒迁移，利用抗原与抗体专一性结合作用和激光光散射检测反应颗粒的个数，检测限达 1 zmol。放射法等49了一种柱后放射性检测装置，用 35S，32P，3H 标记氨基酸，经毛细管电泳分离，柱后将毛细管流出液收集在可键合肽的膜上，用 CCD 检测器矩阵检测斑点，获得电泳谱图。1.1.4 毛细管电泳应用研究进展毛细管电泳法克服了因为焦引起的谱带宽及柱效较低的缺点，确保引入高的电场强度，分离质量得到改善，具有分离效率高、快速和灵敏度高等特点，而且

27、所需要的样品少、成本低廉，更为重要的是，它是一类自动化的仪器分析方法。毛细管电泳其他的经典电泳技术相比，不仅仅具有高效液相色谱和高压电泳等优点，而且具有自身突出的特点：(1)(2)(3)(4)耗样少，因此可应用于微小体积蛋白质样品的快速高分离效率，快速，高分辨率；具有重现性好，灵敏度高的特点；及分离；操作模式很多，通用性较广；CE 具有丰富的分离模式，能实现非水和水的分离，能够对付尺寸不同的样品分子，能够覆盖较大范围的等电点(PI=1-12)等。毛细管电泳和高效液相色谱都是液相分离技术，而且两者在很大程度上互为补充，但无论从效率、速度、成本及用量上来说，毛细管电泳法都显示出了它的优势。例如毛细

28、管电泳法的成本相对比较低，并且可以通过改变操作的模式和缓冲液种类，根据分子的不同性质(大小、电荷数量、手征性、疏水性)对多种物质进行有效分离，而高效液相色谱法要用价格昂贵的溶剂和柱子。1.2 单细胞分析细胞作为有机体结构与生命活动的基本有重要作用。生命运动离不开细胞， 如：细胞的新陈代谢、呼吸作用及光合作用等过程都与细胞的整体状态息息相关。细胞化学是介于细胞形态学与化学及生物化学之间的一门边缘科学，它是依据已知的化学反应，在细胞原位上根据化学反应显示出该细胞中的化学成分、性质及变化，从而将结构和功能紧紧联系在一起。研究细胞化学不仅仅有利于形态联系功能及代谢，定位显示出化学性质及化学成分，且还有

29、助于确定细胞的特征、细胞发生中的特征以及化学成分的变化规3细胞疾病状态、鉴别、预后判断等50。律、对单个细胞质、单个细胞器、全细胞进行全面的分析研究,有可能会解决同种细胞是否具有相同功能、细胞生物及其生理行为与细胞形态及其化学组成间的相互关系、细胞变异和细胞通信的生物化学基础等生物学与医学中一些尚需解决的问题。单细胞进样单个细胞溶解进样51-54微注射器压力样。Krylov55等采用微注射器进样分析单细胞。将单细胞经分离后放置于微型管状瓶中，试剂加入发生衍生化后用微进样器从中移取部分溶液加入分离毛细管内，再进行分离检测。此方法有以下优点：溶解细胞时反应完全，内标或衍生试剂与检测的试样充分混合，

30、使检测样品的衍生反应完全，检测的误差较小。缺点是样品经稀释后不能进行全部进样，使得该方法的检出限较差，应用范围受到限制。单个全细胞进样56-59在毛细管电泳的单个分析中，大多数都采用单个全细胞进样。分离的细胞用电迁移60或流体动力学，将整个细胞进样到分离毛细管内进行细胞膜溶解61-63，再用高压电泳进行分离及检测。由于将单个细胞全部进样保证细胞 100%全部进样，细胞内的低含量组分会获得最佳检出限。Cooper等64直接采用电动迁移的方式将单个细胞引入毛细管中，即在细胞数目一定的条件下，利用细胞本身在溶液中的漂浮和移动，在细胞漂移慢慢靠近管口的时侯，电动迁移会将细胞移进毛细管中，此过程一般不会

31、超过2分钟。Jin等65设计并制造出了一个具有多种功能的进样器，该进样装置具有透明结构，不需要对毛细管进行蚀刻处理，将用于分离的毛细管竖直放在需要检测的细胞上，通过显微镜的观察，采用压力或电动迁移的方法引入细胞。加入SDS进行细胞溶膜，而且在进完单个细胞后，可以对毛细管进行自动的（3）细胞质取样。单个细胞细胞质的取样，可以直接用于单细胞的分析。宾州大学的Ewing 研究小组曾提出三种形式：其一，把毛细管的尖端拉至直径为几微米，装入缓冲溶液并将其当做微进样器，然后通过控制微进样使其准确地神经细胞中，然后将电泳管的正到微进样器中，最后启动高压完成电迁移进样66；其二，用外径大约为几十微米的双微管进

32、样器。用碳将微管的管尖进行密封，在其铂丝（导电作用），当将其细胞中后，再用用电动迁移的方法从另一管中移入要进行分析检验的细胞质样品中67,68；其三，用氢氟酸将内径 5 m 的毛细管的进样端的外径进行蚀刻到大约 6-10 m，通过显微镜的观察，直接到多巴胺的神经细胞体内，采用电动迁移的方式，将其中一部分4细胞质移动到毛细管中，然后开始进行毛细管电泳分离。进样的体积在 50-83之间，其中最小进样量可以达到 270 fL69。但因为细胞得直径非常小，微型进样器尖端很难准确地到细胞中，该进样法大多用于蜗牛的巨大神经细胞进行分析，对人的血红细胞1.2.2 细胞溶膜或哺乳动物的神经细胞分析目前尚无。在

33、单细胞的毛细管电泳分析中，柱上衍生方法因为其操作比较方便，衍生时对溶液稀释作用较小，保证组分 100%的进行进样，所以是单细胞分析中使用较法70。但这种方法要求在细胞进入毛细管的进样端后必须有合适的多的溶膜方法。对于柱外较多细胞的溶膜，常用超声破膜法，机械匀浆法，快速冷冻-融化法及化学试剂溶膜法等。但要将这些方法不是非常适合直接应用于毛细管内单细胞的溶膜。例如快速冷冻-融化法操作过程中容易使毛细管内产生许多气泡，从而导致电泳分离失败。超声溶膜使用不恰当会对单细胞组分溶膜产生较大的稀释，导致区带展宽。在化学试剂溶膜方法中，最常用的一种溶膜剂是SDS，但应用分离测定单细胞中的蛋白质及酶时，可能会使

34、蛋白质和酶发生变性；需衍生胞内组分时很可能影响衍生。（1）电泳缓冲液溶膜法不同的细胞对外界环境变化的忍受程度不同。有些细胞只需环境值或离子强度有稍微的变化，细胞就会溶膜，例如鼠的交感神经细胞、红血球细胞等，常用的缓冲液即可溶膜71。化学试剂溶膜法巨噬细胞、淋巴细胞等在一般的缓冲液中难以实现溶膜，可以采用加入些化学试剂使膜溶解，这些化学试剂主要包括十二烷基硫磺酸钠（SDS）、强碱如NaOH等。超声溶膜法Zhang等72在分析单个结肠癌细胞株细胞时，采用超声溶膜法。当单个细胞进入毛细管进样端后，继之电迁移引入衍生试剂。之后把进样端放入一个含操作缓冲液的小管中然后放入超声容器中65度30 s溶解细胞

35、。脉冲激光细胞溶膜法Sims 等73曾使用脉冲激光进行细胞溶膜。脉冲激光经过显微镜的物镜聚焦在载波片与单细胞所处的缓冲溶液的界面处。光束聚焦点距离单细胞约 20 到 30m 的侧面。细胞经过特定功率的脉冲激光照射时，产生的热量能在 33 ms 内使细胞溶膜。该方法的优点是单细胞溶膜所需时间非常短（33 ms），从而避免了细胞会在外界下，可能会引起的细胞内组分发生改变的化学变化。特别是一些与酶有关的化学反应，其浓度会在一秒内发生 1-104 个数量级的变化。51.2.3 细胞衍生单细胞内许多物质因没有天然的荧光特性或电化学活性，所以要对这些物质进行检测分析就必须经过衍生化。一般来说，衍生的主要目

36、是用来提高检测的灵敏度，即将低检测响应的化合物转变为具有高灵敏度检测的物质，并且通过衍生还能改善整个分析检测过程的选择性。总的来说，检测灵敏度的提高是第首要的。单细胞衍生方法有柱前、柱后、柱上和细胞内衍生。柱前衍生是指先将单个细胞进行溶膜，使细胞内组分通过衍生反应后再注入毛细管中进行电泳分离的一种分析方法。柱前衍生具有很大的性。对于单细胞分析胞内组分的柱前衍生一般两种方法：细胞衍生法与溶解细胞衍生法。Havery 等74将单个神经细胞用 NDA 进行衍生后，通过进样分离，从而快速检测出了十多种氨基酸。柱上衍生法是指先把衍生试剂溶入到相，再加入样品，使分析物和衍生试剂在相中充分反应，不稳定的衍生

37、物比较适合该方法，并且反应速度要快，衍生试剂的用量非常大，对于昂贵的衍生试剂不宜采用。单细胞的柱上衍生操作模式有二种，第一种是先将细胞移入到毛细管内，再通过电迁移或者压力进样方法使细胞溶膜并和衍生试剂进入毛细管，把毛细管直接作为生化反应池，当溶膜及衍生反应完成后再将进样端移回缓冲液中继续进行毛细管电泳分析检测。 Huang等75最早对单个鼠嗜铬细胞(PC12)衍生反应后进行分析，共检测出了5种氨基酸和多巴胺的含量。柱上衍生的第二种操作模式是先把细胞溶膜剂、衍生剂及缓冲溶液混合在一起，使细胞进样后方可进行电泳分离分析检测，把细胞溶膜、衍生过程和分析在柱内迁移时完成。Oguri等76用该种方法荧光

38、检测出了肥大细胞内的内源性组胺。单细胞柱上衍生方法操作非常简单，反应器所需体积小，减少了对样品的处理和转移，但同时过量的衍生试剂不影响检测分析。柱前和柱后衍生法主要是对分析物进行多重标记，从而导致电泳峰的分析及定量难以得到分辨。尽管柱后衍生能够克服这一缺点，但是需要进行衍生的反应速度必须非常快，一般要在短短几秒内要完成。Gorman77小组共同设计了一套流体间歇式柱后反应设备，并广泛应用于 OPA 柱后衍生氨基酸、蛋白质，很大地改善柱拖增宽现象。该装置用 NDA 进行柱后衍生，已应于测定蜗牛神经细胞及单个血红细胞中的组分。细胞内衍生是将细胞转移到充满衍生试剂的培养液里，使衍生试剂穿过细胞膜进入

39、细胞内，对待分析物进行衍生。要求衍生产物不能渗出细胞外且要保持细等78用该方法检测了人单个血红细胞内的谷胱甘肽含量。利用胞的完整。mBBr 荧光试剂进行柱前衍生，在 37 下培育 60 分钟，使 mBBr 透过细胞膜后和 GSH 进行衍生反应，细胞完成溶膜，电泳分离并实现激光诱导荧光检测。61.2.4 单细胞分析应用（1）神经细胞1988 年，Ewing 小组79首次开始采用细胞质取样，分析蜗牛 anorbisCorneus 巨大神经细胞。微进样器长约 1 mm，尖端约为 7.5 m 取样时，将微进器控制其尖端准确细胞内，再把内径 12.7 m样器充满缓冲液，然后用微电泳毛细管的阳微进样器中，

40、启动高压电迁移进样，CE 分离法检测，但未证实各电泳峰的成分。（2）血红细胞2000 年，睿等80采用毛细管电泳柱端检测分析单个人血红细胞中的谷胱甘肽。以金/电极为工作电极，不需要衍生。谷胱甘肽的质量检出限达26 amol，采用 10 m 的分离毛细管，以一定量血红蛋白使管内壁吸附饱和，不影响测定。测得单个人血红细胞胱甘肽平均含量为 97 22 amol。（3）淋巴细胞1996 年，Xue 和 Yeung 81应用 CE 结合 LIF 研究了单个淋巴细胞。测定了正常的及白血病的淋巴细胞中乳酸脱氢酶同工酶。因淋巴细胞在运行缓冲液中很难破膜，因此采用特斯拉线圈诱导电场将淋巴细胞破膜。此法不影响乳酸

41、脱氢酶的活性。单细胞中五种乳酸脱氢酶同工酶的活性差异主要是源于细胞的大小（6-14m）以及细胞的。（4）啮齿类哺乳动物细胞1996 年，Yeung 小组82提出用 CE 分离 LIF 检测研究单个鼠腹腔肥大细胞胞吐释发 5-羟色胺。单细胞进样后，一种可以促使肥大细胞脱颗粒的促剂丝裂霉素 B 被电渗引入毛细管，接着电泳分离 1 分钟以便出的 5-羟色胺区带与细胞分离。最后，引入 SDS 溶解细胞释发剩余 5-羟色胺。经电泳分离检测， 5-羟色胺的检出限为 1.7 amol。每个细胞平均含 1.6 0.6 fmol 5-羟色胺。两批细胞平均释发 5-羟色胺分别为 2814% 和 3815%。1.3

42、 样品堆积场放大效应毛细管电泳（CE）因其具有分离效率高、分析速度快、用量少等优点在环境分析、食品分析中具有广泛应用83-85，但毛细管电泳-紫外检测器较低的灵敏度仍是限制其发展的一个瓶颈。怎样提高检测的灵敏度以满足检测复杂样品中痕量或超痕量组分的要求仍然是电泳研究领域中的一个焦点富集技术是在样品分离或进样过程中用来提高灵敏度的方法，常用的有场强放大86、动态 连接87、推扫88、碱坝聚焦89、等电聚焦90等技术.1.3.1 场放大富集基于溶液电导差异和离子淌度的电泳富集法近年来得到快速发展，如场放大lified Sle Stacking, FASS)91，大体积样品堆积样品堆积(Field-

43、7（Large-volume Sle Stacking, LVSS）92，等速电泳（Isotachooresis, ITP）93，修饰法(mediated)94，动态联接法95，乙腈法96，胶束作用法(eractionbetnytes and micellar, INAM )，瞬间移动化学反应界面法( tMCRBM )等。这种方法是基于分析物在两个导电性不同的相界面上（如样品缓冲溶液和电泳缓冲液交界面）电泳速度的差异而形成富集效应。常用的有基质场放大和柱头场放大。实现场放大要求两相溶液的导电性差异不低于一个数量级（10倍），并且灵敏度提高的倍数与其差别的大小成正比，但这种差别却不能无限扩大，因

44、容易造成两相溶液的电渗流（EOF）不匹配。基质场放大基质场放大是指要降低样品溶液的离子强度，例如在样品基质中加入乙腈（ACN）、去离子水或是经过液相、固相抽提纯化后再溶于低导性基质而后施加一定电场，因为样品溶液电导性差、场强高、分析物泳动加速，所以当其进入低场强的背景电解质溶液（BGE）和样品溶液的交界面时，速度骤降，堆积于毛细管进口端。采用基质场放大存在的一个问题是，当样品溶液成分复杂，特别是一些具有高盐浓度，成分复杂而又微量的样品（如生理溶液）降低电导性的操作不容易实施.其次，这种技术能够使灵敏度提高在很大程度上取决于样品缓冲液和电泳缓冲液离子强度存在的差别，差别越大，场强差越大，富集效果

45、越好，但离子强度差加大后可能引起两相溶液中电渗流处于不同的状态，造成区带扰动，使原本很窄的样品区带展宽，影响灵敏度的提高。柱头场放大柱头场放大是在毛细管的进口端注射一段低导性的液体柱（通常为水柱）。柱头场放大具有极高的灵敏度，电动进样时间可极大延长，关键是柱头水柱的长度要适当，太短则离子很快进入水柱中，提供的时间有限，太长则影响分离度并且滞留水中的低导性溶液会对后续的分离场强产生极大的影响。柱头场放大和基质场放大一样，依然存在同样：对高盐样品溶液灵敏度较低。主要是因为高盐溶液场强低，在相同的电动进样条件下，进样量要比低离子强度的溶液少得多。因此，在实际应用中常见的是边降低样品基质离子强度边使用

46、柱头场放大，即柱头场放大和基质场放大联合使用。Li等97在电动进样前（20 KV,25 s）加3447 Pa,3 s水柱来提高CE对士的宁和番木鳖碱的检测灵敏度，将检测限分别降至2.0 ngml-1和2.5 ngml-1，并实现对尿液中这两种物质快速而灵敏的测定。1.3.1.3 联合使用基质场放大和柱头场放大这种方法是在柱头注射一段低导性溶液增强柱头场强的同时，也降低样品溶液的导电性，进一步提高进样量，其优势在于结合了两种方法的优点。8等用碱坝聚焦毛细管电泳建立了测定多种芳香胺的方法。Zhang等98利用推扫技术建立了疏水性苯胺类物质分离及富集方法。苯胺类物质为有机弱碱，在低介质中可以实现质子

47、化，适于使用场强放大技术进行富集，易于实现glL-1级的检测水平。99，通过文献浓缩技术会显著提高CZE 或胶束电动毛细管色谱(MECC)的检测灵敏度，例如场放大样品堆积技术( field-lified sle stacking,FASS)。这一方法是根据样品溶液与缓冲液的不导率来实现样品的富集。分析前用具有高电导率的缓冲液冲洗毛细管并用其充满毛细管；之后加入一小段水柱，最后以电迁移的方式进入低电导的样品溶液。因为缓冲液的电导率高于样品溶液的电导率，所以在毛细管中的样品段能够形成高的电场，使被分析检测的组分在样品溶液和水柱中的迁移速率要大于在缓冲液中的速率。因此，在水柱与缓冲液的交界处会形成一

48、个狭窄浓缩的组分带，可大大提高检测的灵敏度。1.3.2 场放大技术的发展趋势目前，各种提高毛细管电泳检测灵敏度的技术层出不穷，而场放大技术以其高效率的特点成为研究的热点。尽管场放大技术是一种较有效的富集技术，但对样品溶液离子状态有很高的要求，使得它在实际应用中受到很多限制。因此，目前采用 的是将场放大与样品溶液的SPE，LLE，SDME（单滴剂微抽提）ITP等技术结合起来使用，一方面可以实现优势互补，经过SPE等处理后的样品不但没有了高盐成分的影响，而且其除杂的过程同样在一定程度上增加了分离度，避开了基质杂质对检测的干扰；另一方面两种或多种方法进行叠加的效果，能进一步提高检测的灵敏度。另一个趋

49、势是场放大技术应用毛细管中，因毛细管的机制与常规毛细管的不同，所以怎样使场放大技术在MCE中发挥重要作用，促进毛细管电泳技术逐渐向高通量、快速、微型方向发展也是场放大急需解决的问题之一。1.4 展望毛细管电泳的单细胞分析早期主要应用于神经科学领域。用蜗牛的巨大神经细胞当作分析对象，分析物大多有神经递质和氨基酸。并且随着这门技术的逐渐完善，具体应用也扩展到哺乳动物体内的单细胞甚至单个植物细胞的分析，能够分析的物质种类也在渐渐增多。单细胞内从小的无机离子到大的肽，蛋白质等的分析都有研究。单细胞 CE 分析的应用前景尽管十分广阔，但仍存在许多需要解决欲使这种方法能够得到更加广的应用，还必须要在采样，

50、分离，检测。上做进一步改进和发展。取样是单细胞 CE 分析的关键步骤之一。单细胞 CE 分析的取样的进一步的微型化，才可能测定出单细胞中待测物的空间分布，还可进一9步检测细胞结构功能体内的组分或进行细胞膜结构的分析，如细胞内泡囊或神经细胞的突触等。生物体系对分离的要求非常高，寻求多种 CE 分离模式，CE 与其他联用将有效的提高分离的效能，实现单细胞中组分的分离。CE 已在单细胞分析中显示出很好的优越性，并已经实现了具体的应用。作为细胞研究的一种重要工具并随着这种方法的推广，它将会在医学，生物学，细胞学，药理学等各种学科和研究领域受到高度重视，并取得更快的发展。10参考文献1, 李瑞雪, 高效

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