DNA复制、修复课件

1、第 19 章DNA复制、修复19.1 DNA复制总观 19.1.1 半保留复制 19.1.2 复制子、复制起始点 与方向 19.1.3 DNA复制的其它模式19.2 原核生物的DNA复制 19.2.1 DNA聚合酶I 19.2.2 DNA聚合酶、 19.2.3 DNA复制的真实性19.2.4 DNA的生物合成19.2.5 DNA复制体及 相关蛋白19.2.6 DNA复制的起始19.2.7 DNA链的延伸19.2.8 复制的终止19.3 真核生物DNA的复制19.4 反转录19.5 DNA突变与修复12345中心法则基因(gene):是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是

2、各种RNA6复制的要点: 1 半保留复制2 有起始点、终止点和方向3 半不连续复制5297当细胞分裂, DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的。另一股单链完全重新合成，且按碱基配对原则互补。DNA复制总观1半保留复制:8如果DNA全保留复制：新合成的子链全部进入子细胞第一代第二代细菌（含15N-DNA)重DNA轻DNA重DNA 重DNA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA轻DNA9DNA半保留复制的证据第一代第二代细菌（含15N-DNA)轻DNA轻DNA重DNA 重D

3、NA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA轻DNA10复制子(Replicon)：Genome上能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是都是环状双链分子，都是单复制子。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子长约200Kbp。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。 线粒体、叶绿体DNA一般是单复制子。复制子、复制起点和方向11复制方向复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。12用放

4、射自显影实验判断DNA的复制方向及速度a. 单向b. 双向等速c. 双向异速13环状DNA复制起点的gene mapping P53214（一）、环式DNA复制 环状单链DNA，x174（二）、D环式 线粒体、叶绿体DNA 不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。DNA复制的其它模式1516 DNA聚合反应必备的条件：1.底物 dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶 DNA聚合酶（DNA依赖的DNA 聚合酶) DNA-pol3.模板单链的DNA母链4.引物寡核

5、苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子 解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶原核生物DNA复制2DNA聚合酶I、II、III17DNA聚合活性（ 5 3 ）pppppppPPPOHOHOH55PPiN1N2N3N1N2N3533DNA聚合酶的活性533535外切酶活性53外切酶活性核酸外切酶活性18DNA聚合酶的反应特点： 以4种dNTP为底物 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。 反应需有引物3，-羟基存在 链生长方向5， 3， 产物DNA的性质与模板相同DNA生物合成53，化学合成3519聚合反应总反应式n1dATPn2dGTPn3dCTP n4dTTP+DNADNA

6、pol ./ Mg2+ +（n1+n2+n3+n4）PPidAMPdGMP dCMPdTMPDNAn20（1）E.coli. DNA pol. I（Kornberg）单体酶，催化活性：5， 3， 聚合活性3， 5， 外切活性（校对）5， 3， 外切活性（修复）用蛋白水解酶将DNA pol.部分水解可得：大片段（Klenow）：5， 3，聚合活性、3， 5，外切活性。小片段，36Kd，活性：5， 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。DNA聚合酶I、II、III21（2）E.coli. DNA Pol.单体酶，催化活性：5， 3，聚合(活性很低)3， 5，外切可能在DNA的

7、修复中起某中作用。（3）E.coli.DNA pol. 寡聚酶。DNA pol.是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)P539 表19-1 E.coli三种DNA聚合酶的性质比较22 DNA聚合酶催化的分子机制 来源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反转录酶甚至RNA聚合酶的聚合酶区域都有一个类似手指、手掌和拇指的基本结构，存在相似的折叠结构。2324通过晶体结构和模型研究发现， 手指区域可与未复制的单链模板相互作用，同时手指区域的一部分也参与结合进入底物dNTP。 拇指亚区可与模板引物DNA双螺旋相互作用。 聚合酶通过保守的氨基酸残基与引物模板复合物相互作用使引物的3末

8、端定位在手掌和手指的会合点，并与dNTP相对。2526研究还发现，dNTP的进入伴随着两个Mg2离子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反应的双金属离子机制（two metal-ion mechanism)。核苷酸的掺入是受模板指导的，所以DNA聚合酶在每个催化循环中都要改变它的核苷酸底物专一性。27DNA聚合酶的聚合反应的保真机制dNTP的参入遵循碱基配对原则DNA聚合酶3， 5，核酸外切酶活性校对机制切除错配的碱基核苷酸代谢库调节系统和修复系统调节dNTPs的水平切除修复、错配修复系统DNA复制的真实性28DNA聚合酶III有6个结合位点 模板DNA结合位点 引物结合位点 引物3，-OH位

9、点、反应位点 底物dNTP结合位点 5， 3， 外切位点 3， 5， 外切位点(校正)DNA聚合酶III催化DNA合成29DNA聚合酶III的亚基组成由10个亚基组成亚基： 53 聚合酶活性亚基： 3 5外切酶活性亚基： 促进 3 5外切酶活性核心酶30复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。DNA复制体及相关蛋白3132DNA复制过程： DNA解螺旋酶解开双链DNA。DNA促旋酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 SSB结合于D

10、NA单链。 DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。 DNA pol.在两条新生链上合成DNA。 DNA pol切除RNA引物，并补上DNA。 DNA ligase连接封口。331.解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶、与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的53方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿35方向移动。 342.单链DNA结合蛋白（SSB）复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。 353.DNA促旋酶属DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制

11、叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。 364.DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。37复制过程中各酶和蛋白质因子的作用38DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB（单链结合蛋白）结合到单链上使其稳定。引

12、发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC）构成的复合体，负责RNA引物的合成。引发体沿着模板链35方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。引物的合成方向也是53方向。DNA复制起始39 引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。SSB40大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：DnaA 在原点处打开双螺旋DnaB 使DNA解旋DnaC DnaB结合在原点所需Hu 刺激起始引物酶（DnaG） 合成RNA引物SSB 结合单链DNARNA聚合酶 促进DNaA活性DNA促旋酶 松驰DNA扭曲应力41链的延长反应由DNA

13、pol.III催化。 在DNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTP为原料，进行聚合作用。即新进入的 dNTP 与引物 3OH形成磷酸二酯键，由53方向延长子链。DNA链的延长4253355解链方向3冈崎片段(Okazaki fragment)43前导链：合成方向与复制叉移动方向相同的子链DNA滞后链：复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。1968年，冈崎发现DNA复制中出现一些不连续的片段，称为冈崎片段。长度：细菌：1000-2000bp，相当于一个顺反子的大小。真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。4445

14、滞后链的合成合成方向与复制叉移动方向相反分段合成带有引物的冈崎片段引物酶的激活滞后链合成完后，引物的去除去除引物后缺口的填补冈崎片段之间的连接465335polpol 5 3外切酶活性水解引物pol聚合活性填补空隙DNA连接酶连接缺口。471. 原核生物在复制终止点的汇合2. 真核生物复制的终止DNA合成的终止48细菌环状DNA，复制叉相遇即终止。单向复制的环形DNA，复制的终点就是起点。大肠杆菌的7个终止位点1 原核生物在复制终止点的汇合49 真核生物复制的终止染色体DNA呈线性，复制在末端停止。50端粒(telomere)真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。结构特点：1. 由末端单链D

15、NA序列和蛋白质构成2. 末端DNA序列是多次重复的富含G、C 碱基的短序列 功能：1. 维持染色体的稳定性 2. 维持DNA复制的完整性51端粒酶(telomerase) 特点：1. 由RNA和蛋白质构成的复合物2. 为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为 模板逆转录合成端粒DNA功能：合成端粒DNA，维持端粒的长度52爬行模型：53染色体末端复制-端粒与端粒酶后随链中RNA引物的切除与gap产生及由端粒酶对DNA5端的延长54端粒及端粒酶的意义： 端粒的长短及端粒酶活性变 化与细胞水平的老化(aging)及 肿瘤的发生有一定关系。55端粒DNA的复制与细胞衰老端粒（telomeres） ：是

16、真核细胞染色体末端所特有的结构，一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，。功能：保证线性DNA的完整复制保护染色体末端决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。56真核生物DNA的复制3核小体（nucleosome） 真核生物染色质DNA是线性双螺旋，它缠绕在组蛋白的八聚体上形成核小体。57真核生物DNA复制的特点真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢。 （10003000bp/min） （50000bp/min）原核生物快速生长

17、时，采用多复制叉复制。真核生物快速生长时，采用多起点复制。58真核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶：多亚基，是真核DNA的复制酶。 DNA聚合酶：主要在DNA损伤的修复中起作用。 DNA聚合酶：从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。 DNA聚合酶：有3， 5，外切活力55159反转录（reverse transcription）：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。 反转录酶具有三种酶活力：（1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，形成RNADNA杂种分子）。（2）RNase H酶活力，水解RNADNA杂种分子中的RNA。（3）DNA

18、指导的DNA聚合酶活力。模板：RNA或DNA 引物：RNA或DNA底物：dNTP 二价阳离子：Mg2+或Mn2+反转录460反转录病毒的基因组结构（1） 反转录病毒基因组通常由两条相同的（+）RNA链组成。5端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。（2）每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（3） 5端有帽子结构，3端有polyA，与真核mRNA相似。 （4）5端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是tRNApro61RNA 病毒的反转录过程反转录病毒的生活周期（1）病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞

19、。（2）RNA被反转录成双链DNA（前病毒），环化，进入细胞核。（3）反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。（4）前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。（5）基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。62反转录的生物学意义理论意义1.是Crick中心法则的补充2.为致癌RNA病毒、肝炎病毒防治提供基础3.真核生物细胞中也有逆转录酶存在 （逆假基因、假基因）实践意义指导肿瘤的防治和药物设计应用于基因工程63突变 (mutation)：遗传物质结构改变而引起 的遗传信息的改变，也称为DNA损伤 (DNA damage)。

20、从分子水平来看，突变就是DNA 分子上碱基的改变。 自发突变、人工诱变突变的意义突变是进化、分化的分子基础只有基因型改变的突变致死性的突变突变是某些疾病的发病基础DNA的突变及修复564诱变剂：65突变的类型：点突变：DNA错配碱基在复制后被固定下来，由 原来的一个碱基对被另外一个碱基对所取代。移码突变：缺失和插入引起的三联体密码的阅读 方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。66点突变 (point mutation)转换 (transition)：发生在同型碱基之间的置换。 两种嘌呤之间，两种碱基之间颠换 (transversion)：发生在异型碱基之间的置换。 一种嘌呤与一种嘧啶之间

21、 67移码突变：正常5 GCA GUA CAU GUC 丙 缬 组 缬缺失C 5 GAG UAC AUG UC 谷 酪 蛋 丝68DNA修复为了保证遗传信息的高度稳定性，生物细胞在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制。目前对DNA损伤和修复的研究还不多，仅限于辐射生物反应方面。69一、切除修复1. 碱基切除修复（base excise repair，BER）BER可以去除因脱氨基或碱基丢失，无氧射线辐射或内源性物质引起的环氮类的甲基化等因素产生的DNA损伤。BER是维持DNA稳定的重要修复方式，其步骤是N-糖苷键水解，从而切除发生变化的碱基。碱基释放过程是由DNA糖苷酶催化的。7071722

22、. 核苷酸切除修复（nucleotide excise repair, NER）NER可以修复UV照射形成的嘧啶二聚体以外，还能消除体内产生的各种嘌呤和嘧啶加合物。NER的关键特征是对损伤的DNA链的两端进行切割。NER在已研究过的真核生物中都很相似，说明其在进化过程中高度保守。737475二、直接（回复）修复 直接修复即简单地把损伤的碱基回复到原来状态的修复，可分为以下几种：1. O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶直接修复 通过从O6-甲基鸟嘌呤上把甲基直接转移到酶的半胱氨酸残基上来直接回复DNA的损伤。76772. 光解酶复活酶学光复活过程是修复UV导致的环丁烷嘧啶二聚体的直接机制，这种修

23、复具有高度的专一性。3. 单链断裂修复DNA单链断裂是损伤的一种常见形式，可以通过DNA连接酶的重接而修复。78三、错配修复错配修复可以纠正几乎所有的错配。此外对于对于插入或删除引起的DNA遗传信息的改变也有作用。错配修复是以底物链上的信息为模板进行的，因此这个系统有区分底物链和新合成链的机制，细胞通过识别DNA链的甲基化状态来区分底物链和新合成的链。整个修复过程可以分为识别、切除和修补等步骤。79808182四、交联修复链间交联是由多种多样的致癌剂和化疗药物等引起的。大肠杆菌和哺乳动物细胞内都存在这种修复机制，但细节还不清楚。五、双链断裂修复双链断裂（DSB）发生在体细胞重组和转座的生理条件下，也是电离辐射和氧化应激的主要损伤形式。依赖DNA的蛋白激酶对哺乳动物细胞中