羟基自由基清除能力的抗氧化能力评价 脱氧核糖法

1、羟基自由基（0H ）清除能力的评价：脱氧核糖法脱氧核糖法检测羟基自由基清除能力与溶剂影响【总流程图】脱组核糖法评价（0H ）清除能力的总流程图说明：脱氧核糖降解试验广泛用于评估羟基（0H）食物或药物的自由基清除能力。我们比拟 了在乙醇溶液中制备的25个抗氧化剂样品与去除乙醇（残留物）后制备的样品的羟自由基 清除活性。数据说明，乙醇溶液和残渣样品的测定结果相差约9倍。这说明酒精的强烈干 扰。为了进一步研究其机理，用脱氧核糖法测定了 18种有机溶剂（包括乙醇）的清除活性。 大多数纯有机溶剂（尤其是醇类）都能有效清除羟基自由基。【实例】三种典型的抗氧化剂（含阿魏酸、榭皮素和褪黑素）的浓度响应曲线，在

2、乙醇溶液和挥干 乙醇后的比照。这说明乙醇有严重干扰。图2阿魏酸的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的比照）100-图3榭皮素的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的比照）图4褪黑素（Melatonin）的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的比照）【背景介绍及溶剂影响的原因分析】脱氧核糖降解试验自1987年建立以来，已广泛用于评估食品、营养素和药物的羟自由基 清除能力。在脱氧核糖降解试验中，通过芬顿反响获得0H,随后，-OH攻击脱氧核糖并打 破其环味喃环，生成丙二醛（MDA）。MDA与2-硫代巴比妥酸（TBA）结合，在530 nm处 产生Lax的有色物质。CHOHHHOH 一包一-HCCH2CHOHCH

3、2OHTBA （2-硫代巴比妥勖TBARS （ 2-碇代巴比妥酸反响产物）530 nmHCCH2CH g 2MDA旃二醛）因此，A53m值与生成的羟基自由基的量成正比，A530nm值越高，说明OH自由基水平越高。 如果添加抗氧化剂样品，A530m值将降低，说明抗氧化剂清除了一些OH自由基。这是脱氧 核糖降解测定的原理。与大多数生化分析一样，脱氧核糖分析需要在测量之前使用各种有机溶剂制备样品溶液。 然而，据观察，通常用于制备这些样品溶液的有机溶剂（尤其是醇类）可能会产生强烈干扰， 而这些干扰往往被分析用户忽视。几个研究小组明确表示,他们使用有机溶剂制备样品溶液, 样品溶液直接用于脱氧核糖测定。例

4、如，至少有七组报告称，他们使用酒精溶解样品，这是 通过分析直接测量的。一个研究小组甚至直接将食用葡萄酒用于检测，以评估葡萄酒中酚类 化合物的羟基清除能力。由于抗氧化剂样品的水溶性通常缺乏以在室温下制备样品储藏溶液,我们认为有更多的研 究小组使用有机溶剂溶解样品，因此可能会出现问题。甚至更广泛。因此，所有这些调查都 被认为是不可靠的。因此，在本研究中，我们系统地研究了各种溶剂的作用，以提高脱氧核 糖分析性能。【实验数据支持】在本研究中，我们首先比拟了 25种抗氧化物（结构式见图5）在乙醇溶液中和在缓冲液中 （去除乙醇后）的残留物的羟自由基清除活性。为了探索酒精干扰的机制，使用原始的化学试剂测定了

5、纯乙醇的羟自由基清除能力脱氧 核糖测定。结果说明，乙醇本身呈现剂量-反响曲线，在800微升的反响体积中，其ICso仅 为1.860.13微升。这意味着少于3微升的乙醇足以清除大多数羟基自由基（90%）o这些 结果与之前的报告一致,即乙醇可以作为自由基清除剂，并可以保护DNA免受清除羟基自 由基的影响。总之，酒精对测定的干扰源于乙醇本身的羟自由基清除能力。OOH5阿葭酸4姜黄素2 BHA1 （十）儿茶素7 8-羟基噎琳衍生物9桑橙素6 GSH13相罟素omH15原儿茶酸18“皮素16品根素23 生育酚24 Trolox25尿眠院20声丁沉香叶的甲酣提取物11 MEASCHjCCOOH8异阿et戢

6、姣股蓝的甲醇提取物 12 MEGMHOOCCHCH/：H2C-NiNH； y.2 H HC-N-CH?COOH10 廓CH20H17叱哆降COOHHCHy22百里香的19迷送香酸图5,25种抗氧化剂的结构为了系统地研究溶剂效应，使用原始脱氧核糖测定法测定了另外17种纯有机溶剂的干扰。 数据说明，所有溶剂都能有效清除羟基自由基。我们根据IC的值将有机溶剂分为四种主要类 型。正己烷和石油酸是最弱的清除剂正己烷和石油酸（低级烷烧的混合物）是仅包含Q 键（C-H和C-C。键）的碳氢化合物，其具有稳定性，而且耐羟基自由基的损伤。 此外，这些溶剂的水溶性差也阻碍了与水反响系统中的羟基反响。如所示，环己烷表

7、现出轻微的OH清除活性，这可能是由于环状分子固有的环应变 引起的此外，两种典型的芳烧溶剂，苯和甲苯，以及三种卤代烧，四氯化碳、氯仿 和氯甲烷也具有中等活性。芳烧分子含有共趣tt键，其稳定性不如。键，并且可以 与0H自由基反响。然而,三种卤代煌的轻微活性可归因于极性C-X。键（X=卤素）。（3）另外三种溶剂，乙睛、丙酮和二硫化碳，表现出较强的羟自由基清除能力。这些分 子中的非共版不饱和键（C三N, C=。和C二S分别）比芳香煌分子中的共匏兀键。 因此，它们很容易被羟基自由基破坏。（4） 在7个细胞中观察到非常强的0H清除活性有机溶剂，包括乙酸、DMF（二甲基甲酰 胺）、DMSO（二甲基亚碉）、乙

8、醇、乙酸乙酯、甲醇和四氢味喃。乙醐除外（仍然很可 溶），所有这些溶剂都与水所有这些溶剂都包含至少一个。原子，其中形成各种活 性化学键（例如00、H-0和S=0）或官能团（例如羟基、酯、酰胺、亚碉基和环状 乙醛基团）。这些反响性化学键或官能团。对这些溶剂具有强大的羟基自由基清除能 力。重要的是，DMSO,它通常用于生物化学或动物实验的样品溶液制备，显示出非 常强的清除能力（IGo二5.760.76同）。结果与先前的研究一致，说明DMSO可以作 为羟基清除剂，并可以防止羟基自由基对DNA的损伤。溶剂对测定结果的影响源于有机溶剂本身的羟基自由基清除能力，并且可以最终归因于羟 基的极端反响性能.羟基自

9、由基将与周围的溶剂分子快速反响。例如，OH与乙醇和DMSO 的反响速率分别为1.9 x 109 L mol s”和9 x 109 Lmol s。OH与DMSO反响的产物为 CH3o总之，在通过脱氧核糖降解测定进行测量之前，应完全去除任何有机溶剂，否那么结果将 毫无意义。然而，蒸发温度应保持在60C。以下，以防止抗氧化剂样品正在被摧毁。在我们 的实验中，我们发现所有样品残留物都可以很好地溶解在水反响系统中。最抗氧化剂是有机 化合物及其水溶性通常缺乏以制备样品储藏溶液（室温），但通常高到足以溶解在反响系统 （50 C。）。例如,儿茶素的水溶性为2.26 mg/mL（25C）。而其ICso值仅为0.

10、200.0025 mg/mL 一些典型的脂溶性抗氧化剂（如BHA、麝香草酚和生育酚）和两种提取物（MEA和MEGB） 也可以溶解在反响系统中。这是因为：（1）这些抗氧化剂含有酚-OH基团，可以与修0分 子形成氢键，增加水溶性；（2）较高的反响温度（50C。）增加了水体系中的溶解度；（3） 抗氧化剂残留量逐渐减少反响过程中的OH攻击。基于以上讨论，脱氧核糖降解试验可以改进如下：首先，我们选择合适的有机溶剂制备 样品溶液。将一小份样品溶液置于管中，并将该样品溶液蒸发至干燥（水浴，60C）o然后， 按照上述测定样品残留量。改进的脱氧核糖降解试验的整个过程如图1所示。必须强调的是，（1）,如果抗氧化剂

11、样品水溶性不好，我们可以用水（或缓冲液）制备 样品解决方案因为水（或缓冲液）不能和羟基反响自由基、水溶液样品可以直接测量；（2）如 果抗氧化剂样品是热敏的，那么样品溶液应在室温下蒸发至干燥。改进的脱氧核糖测定程序通过使用参考化合物（+ ）-儿茶素。（+ ）-儿茶素的回归方程 相关系数（R）为0.99887o 1的的RSD%为0.51%,符合FDA（美国食品药品监督管理局）要求。除（+ ） -儿茶素外,其他24种抗氧化剂也表现出良好的线性（R二。80304-0.99956,平均R值为 0.93335）和较低的RSD值（0.35-9.07%,平均值为3.38射。显然，改进后的方法具有良好 的线性和精密度。此外，在不同的日期获得的G二值的RSD%为2.26%。（ + ）-儿茶素分析这 说明改进的方法具有良好的再现性综上所述，改进的脱氧核糖测定法（尤其是样品制备） 是合理可行的。如图5所示，25种选定的抗氧化剂包括所有类型的抗氧化剂，如纯化合物和提取物； 天然和合成；外源性和内源性，水溶性和脂溶性、维生素、维生素类似物和非维生素、酚、 多酚、酚酸、类黄酮、原花青素、苯丙素、多肽、杂环酚和碱基对。作为所有这些的清除能 力在我们的实验中可以成功地测量物种，改进的方法证明适用于所有类型的抗氧化剂。【结论】在脱氧核糖降解试验中，任何有机溶剂测量前应完全蒸发，否那么结果将毫无意义。我们 提出的改