综述药品生产车间污染菌溯源技术

1、药品生产车间污染菌溯源技术综述前言：微生物包括：细菌、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它微小，生存能力强，踪迹遍布全球各个角落。涵盖了有益跟有害的众多种类，广泛涉及食品、工农业、环保等诸多领域。200年前列发现微生物世界以后的间，微生物学的研究基本上停留在形态描述和分门别类阶段。显微镜技术使人类开始认识了微生物，然而在对微生物的生 命活动和功能有所知晓之前，微生物学并没有诞生。直到19世纪中期，以法国斯德和德国的为代表的科学家才将微生物的研究从形态描述推进到生理学研究阶段，了微生物是造成发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术。从

2、而奠定了微生物学的基础，促使微生物学 迅速诞生，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。无菌药品是关系国计民生的特殊商品，微生物是无菌产品主要污染来源。可在、物料、公用系统、工艺流程设计、操作设计、包装系统、测试方式方法等各个环节产生。发现异常物质时，首先要确定异常物质是不是微生物？是的话，是什 么微生物？它从哪里来的？如何去除方法？鉴别微生物是任何有关环境或事件 中的基础部分。国内外动态：2015版中国药典全面与国际标准接轨，建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，以掌握微生物菌群信息，有助于制定有效的清洁、及微生物检测方法。通则9204对检出微生物的鉴定已做了明确规定，当微生物的鉴定

3、结果有争氏系统细菌学手册 (Bergeys Manual of Systematic议时，以Bacteriology)现行版的鉴定结果为准。微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其进中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净微生物监测和控制指导原则（通则 9203）中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染。此外，在药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终产品中检出的微生物进行适 当水平的鉴定。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限息相关，未知菌鉴定时通过与

4、微生物鉴定系统中的标准微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户应明确所采用鉴定系统的局限性及所要达到的鉴定水平(属、种、菌株)，选用最适合要求的鉴定技术，必要时采用多种行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药品微生物检验中的重要环节，药典通则相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确规定，如“非无菌药品的微生物检查:控制菌检查”（通则 1106）中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法”（通则 1101）的阳性实验结果鉴定方法确定。目前微生物鉴

5、定方法主要有以下几点：（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性.形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和学反应等.（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础,检测微生物的特征图谱,建立与微生物种类相对应的数据库.通过将待测微生物与数据库参比,得出鉴定结果.该系统已获FDA认可,已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中.CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库,涉及革兰氏菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内

6、近2000种微生物.（3）分子生物学鉴定 由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，所以 DNADNA 杂交、聚合酶链反应、16S rRNA 序列和 18S rRNA 序列、多位点序列分型、焦磷酸、DNA 探针和核糖体分型分析等型微生物鉴定方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系,是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法.CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学,配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列.（4）API细菌数值鉴定系统API鉴定系统涵盖15个

7、鉴定系列,约有1000种生化反应,目前已可鉴定超过600种的细菌.鉴定过程中,可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列,通过将待测细菌与数据库参比,得出鉴定结果.CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Sta系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和菌属（Locuria sp.）进行鉴定.（5）TLC薄层层析CICC将TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定,进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析（氨基酸、糖）,作为

8、划分属特征的重要鉴定技术,起到了良好的辅助作用.（6）全细胞脂肪酸分析鉴定系统 采用Sherlock全自动细菌鉴定系统,通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析,并 与标准数据库进行比对,来鉴定细菌及酵母.该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效之一.微生物常规鉴定技术简介：为了迅速而简单地鉴定一个有机体，鉴定时，一般先将待检菌进行初步的分类。在鉴定工作中所应用的实验项目应保持最少，这是很重要的。为做到这一点，首先必须明确鉴定目的。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球

9、状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平。微生物鉴定的操作技术1、待检菌的分离纯化微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化，微生物在自然界中呈混杂状态存在，每种微生物有不同的形态和生理特征，要了解某种微生物，就必须单独2、表型试验表型微生物鉴定通常需要大量的纯培养物，而微生物的恢复、增殖和鉴定易受性。因此，在表型鉴定时应注意采

10、用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响。目前已有的基于碳源利用和生化反应特征的鉴定方法，如气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征、MALDI-TOF质谱法分析微生物蛋白等微生物鉴定系统，在进行结果判断时需借助于系统自身的鉴别数据库，还依赖特定的培养基和培养方法以确保鉴定结果的一致性。 表型微生物鉴定方法已广泛应用于药品微生物。根据微生物表型鉴定所提供的信息可以判断药品中污染的微生物种类，也可掌握环境微生物菌群的变化，并进行产品的风险评估。在许多质量控制中，单独的表型鉴定结果就能给出充足的信息帮助进行深入，并按需要制定适宜的纠正措施。初筛表型试验 常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检

11、菌的基本微生物特征，将 待检菌做初步分类。常见的初筛试验包括：培养物： 菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素；形态学： 细胞形态、细胞大小、细胞形状、鞭毛类型、内容物、革兰氏染色、 芽孢和抗酸染色、孢子形成模式 ；生理学： 氧气耐受性、 范围、最适温度和范围、耐盐性；生态学：微生物的分离环境、培养基和生长条件等。培养时间影响，事实上许多环境微生物在普通的微生物增殖培养基中是无法恢复的；此外，一些从初始培养物中刚分离出的受损微生物还可能不能完整的表达其表型属把这种微生物分离出来研究。微生物分离和纯化的方法很多，最常用的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线分离纯化，以获取待检菌的

12、纯培养物（单个菌落）必要时可进一步进行纯培养，也可采取稀释分离法，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞(或孢子)尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。微生物的生长条件也是准确测定微生物的重要前提条件，应选择能使特定样品中微生物生长的适宜培养基，可通过细菌生长试验证实。使用培养基前要检查其灵敏度和无菌性。根据不同的检查项目选用各类培养基，确定培养温度和时间。验证实验的采用的培养条件要与实际检测的条件相一致， 以保证实验的真实性与重现性。从药物原材料、制药用水、及生产环境、中间产物和终产品的样品中检出的受损微生物，经分离纯化程序使其由不利生存易产生变化的状态转变为在营养富集

13、和最佳培养温度条件下生存的稳定状态，以保证鉴定结果准确性。初筛试验可为评估提供有价值的信息，对于微生物鉴定方法来说，初筛试验是最关键的一步，若给出了错误的结果，将影响后续试验，包括微生物鉴定试剂盒和 引物的选用。 进一步表型鉴定 通过比较微生物的理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异的进一步进行鉴别。生化反应： 碳源的利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式 抑制性： 胆盐耐受性、抗生素敏感性、耐受性 学： 凝集反应、荧光抗体 化学分类： 脂肪酸、微生物毒素、全细胞组分 生态学：细胞成分、表面抗原、生化反应和对抗菌剂的敏感性等表型的表达， 微生物的分离环境、培养基和生长条件等。4、型（分子遗传

14、学）微生物鉴定传统的细菌分类一直以分离培养为前提，然后再依据其形态学、生理生化反应特征以及免疫学特征加以鉴定。只能反映极少数微生物的信息。20世纪6O年代末 Woese CR开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类。分子生物学理论与技术的迅速发展给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新.当代微生物分类学利用遗传学原理和方法分析微生物种、属间的亲缘关系.遗传分类法是根据核酸分析得到的遗传相关性(genectic relatedness)所做的分类.因为这种分类方法是以决定生物表型特征的遗传物质-核酸作为比较的准绳,所以它是一种客观和度较高的分类方法1.目前较常使用的方法有：1 、DNA 中 G+Cmol

15、%分析每一个微生物种的 DNA中 GCmol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中 GCmol%的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的 GCmol%范围。 DNA 中GCmol%分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌 DNA中 GC含量的变化范围一般在 25 75 ；而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围非常窄 (37 51%) 。一般认为任何两种微生物在 GC 含量上的差别超过了10 ，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用 G+Cmol来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。共有两种方法可测，溶

16、解温度（Tm）法*和浮力密度法*。溶解温度（Tm）法的操作步骤菌株培养和收集DNA 提取和纯化Tm 测定计算2 、16SrRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析DNA 提取从平板中直接挑取一环分离菌株细胞,破壁，抽提得到 DNA，加通用引物， PCR扩增，（3）( )，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16SrDNA鉴定结果。3 、DNA-DNA杂交* 结双链 DNA后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。（4）迅速将比色杯内的温度上升到 50左右，取出比色杯检查有无气泡，气泡用手指轻（6）测定

17、终点判断 从 50开始继续加热，同时变性曲线，当温度增加到 A260 吸收不再任何微生物鉴定都应从微生物形态学、生理要求和微生物来源等方面判断鉴定结果是否合理。错误的鉴定会导致不恰当的纠正和预防措施及产品处置。 微生物鉴定方法的确认应包括准确度、专属性、重现性、灵敏度、阳性值、值。型鉴定与表型鉴定的结果差异的情况相对比较少见，例如，具有相同或非常相似的微生物具有不同的表型、具有相似表型的却具有不同的以及型距离很远的微生物不能被归为同种或同属。多相分类学的概念是汇集和吸收了分子生物学、生理学、形态学、学或生态学资源的多层信息进行微生物分类，例如，微生物特征描述、表型和数据及微生物来源等，都可被成

18、功的应用于微生物鉴定中，以避免因使用单一鉴定方法做出毫无意义的结论。 菌株水平的鉴定在污染过程中非常重要，尤其适用于产品中的微生物数量物进行评估。 同一地点的同种菌其表型特征和型特征是基本一致的。不同地点的同种菌表型特征可能基本一致，但保守及可变区域的特征会有一定的差异性。因此污染等应以型特征鉴定为主，表型特征鉴定为辅。 实际工作中无菌试验阳性结果中分离出的微生物，经对其溯源分析，确认污染归因于无菌试验过程中所使用的材料或无菌技术的差错，该试验可判无效，否则判该产品不符合要求。对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行适当比率的鉴定，高于建议水平或出现异常高的微生物检出情况时。菌株水平的鉴定在无

19、菌工艺中也很重要，在无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工艺失败时，必须对检出的微生增加时即为测定终点。（7）GC 含量计算在 0.1SSC 溶液中，G+C mol%的计算公式为： G+C mol%=51.2+2.08（Tm（X）- Tm（R）其中 Tm（X）为待测菌 Tm 值，Tm（R）为 E.coli K-12 的的 Tm 值总结：弹除去。（5）设置测定程序 按照每分钟升温 1的速度设置升温程序，具体的设置方法按仪器使用说明进行。DNA 提取将带测菌株的 DNA 分别装入两只石英比色杯中，塞好带有晶体管点温度计热敏电阻探头的塞子，另一带塞子的石英比色杯装入 0.1SSC 作空白对照。比色杯放入分光光度计的带有加热装置的比色架内，固定波长在 260nm。DNA杂交法的基本原理是用 DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的 DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对（4） 将所得序列通过 Blast 程序与 GenB中核酸数据进行比对分析掌握环境微生物污染情况，有助于污染。 为了确证微生物为同种中的两个相同株，需比对的序列和特征片段，甚至是全的比对，实现既鉴定又溯源的目的，同时保证结果的准确性。此外，有些微生物的溯源还需结合表型特征鉴定，如沙门菌属（ 型的鉴定）