非洲猪瘟实验室监测分析

1、非洲猪瘟实验室监测分析作者：安加俊，杨萍，白波，尚红梅 来源：畜牧兽医科学2020年第15期安加俊，杨萍，白波，尚红梅（陕西省咸阳市动物疫病预防控制中心，咸阳712000）摘要：非洲猪瘟作为一种危害巨大的外来动物疫病，自传入我国，受到全社会的密切关注， 加强非洲猪瘟监测对该病的防控具有重要意义。2018年8月，在全市范围内持续开展非洲猪瘟 专项监测。结果显示：各场点未发现临床可疑病例，12 231份样品核酸检测呈阴性，监测结果 为疫情预警提供重要参考。同时将实验中遇到的的异常情况总结分析，为相关试验检测提供参 考。关键词：非洲猪瘟；监测；分析中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：

2、 10.3969/j.issn.2096-3637.2020.15.008Laboratory Detection of African Swain Fever Virusand Discussion of Exsited ProblemsAn Jiajun， Yang Ping， Bai Bo， Shang Hongmei（Animal Disease Control Center of Xianyang City， Shaanxi Province， Xianyang 712000， China）Abstract： As an exotic animal disease， African

3、swine fever has been introduced into China and has been paid close attention by the whole society . In August 2018， the city-wide ongoing special surveillance of African swine fever . The results showed that no clinical suspicious cases were found in all sites and 12 231 samples were negative in nuc

4、leic acid test. At the same time， the abnormal situation encountered in the experiment is summarized and analyzed to provide a reference for the related test.Key words: African swine fever， surveillance， analysis作者简介：安加俊（1972-），男，汉族，陕西咸阳人，硕士研究生，高级畜牧师，从事畜 牧技术推广和动物疫病预防控制工作。0引言非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、

5、高度接触性传染病。典型临床特 征为病猪突然死亡、皮肤发绀、全身脏器出血，其最急性型和急性型的发病率和死亡率高达 100%，对养猪业危害巨大。世界动物卫生组织（OIE ）将其列为法定报告动物疫病，我国列为一 类动物疫病，也是重点防范的外来动物疫病之一。截止2020年3月底，全国共发生168起疫情， 涉及31个省（直辖市/自治区）、143个市（区、盟）。陕西省目前已发生4起非洲猪瘟疫情。 为及时发现疫源，掌握咸阳市非洲猪瘟病毒污染情况，开展非洲猪瘟临床监测与实验室病毒核 酸检测。1材料与方法1.1临床监测排查（1）排查范围。重点对生猪养殖场、交易市场、屠宰场、无害化处理场等场点的生猪不明 原因死亡

6、或可疑病例进行临床监测排查，结果采取日报告制度。（2）排查数量。2019年1月至2020年3月底，在全市12个县市区、132个乡镇办各类场 点进行36.04万场次，猪只3002.16万头次的排查1。1.2实验室检测（1）样品来源。在咸阳市部分县市区动物卫生监督机构官方兽医监督下，共采集100批次 12 231份EDTA抗凝的全血样品2。（2）检测方法。ASFV核酸检测，采用普通PCR方法和实时荧光定量PCR方法，具体操作 按试剂盒说明书进行。（3）主要仪器。ABIQ3实时荧光定量PCR仪；LifeECO基因扩增仪；II级生物安全柜；全 自动凝胶成像分析系统；台式高速冷冻离心机；高压灭菌锅。（4

7、）检测试剂。柱式DNA核酸提取试剂盒，DNA病毒PCR反应试剂盒，非洲猪瘟病毒实时 荧光PCR检测试剂盒，均购自哈尔滨元亨生物药业有限公司；ASFV普通PCR检测引物，由中国 动物卫生与流行病学中心提供。（5）结果判定。阳性对照Ct值30，出现特定的扩增曲线；阴性对照无Ct值并且无特定 的扩增曲线；结果成立。被检样品Ct值35并出现特定的扩增曲线，判定为ASFV阳性；被检 样品无Ct值，判定为ASFV阴性；被检样品35WCt值40并出现特定的扩增曲线，判定为 ASFV疑似。2 结果临床监测排查结果全市合计排查场点36.04万场次，猪只3 002.16万头次，未发现可疑猪只。实验室监测结果目前共

8、检测样品100批次12 231份，其中种猪28批次计5 968份、仔猪54批次计5 174 份、商品猪7批次计209份、育肥猪11批次计880份。结果全部为非洲猪瘟病毒核酸阴性。3实验室检测异常情况3.1污染出现2020年1月的某次试验，结果阴阳性对照均成立，但23份样品中出现2份可疑（35WCt 值40），见图1，根据实验室以往的统计结果及经验，认为结果可能有疑问，随即对可疑样 品进行了复检，结果均呈阴性，见图2。以上情况提示实验有污染存在。曲1初+*7火尸。日虹I做凶丁 椎焚光iCH打型tEffii普3.2污染查找因为阴阳性质控成立，而且结果中大部分样品呈阴性，所以排除试剂的污染。由于仅部

9、分 样品出现可疑结果，未发现除阳性对照外的其他阳性结果，试验采用商品化试剂盒，因此，气 溶胶造成的环境污染可能性较小。更换实验室对可疑样品重新检测，结果全为阴性，说明样品 没有污染。为查找污染源，在生物安全柜、PCR仪、离心机、移液器、实验台面、冰箱门、实验室门 把手等点位用浸有生理盐水的棉拭子采样后进行核酸检测，结果发现其中1只移液器样品中出 现1份可疑，初步判断污染是由移液器造成。3.3污染排除移液器拆开后可消毒部分用10%的次氯酸钠消毒液进行擦拭，30 min后纯水擦拭，然后用 75%的酒精擦拭，自然挥发。以上处理2遍后移动紫外消毒灯（SW90 cm）照射30 min。处理 完成后再次采

10、样进行检测，结果为阴性，说明发现的污染已清除。为防止出现遗漏，全面彻底清除污染源，对PCR实验室3个区域（试剂储存和准备区、样 品处理区、PCR扩增检测分析区）的仪器设备及双面板、枪头盒等物品按照10%次氯酸钠 （30min）-纯水-75%酒精-紫外灯（30 min）的方法进行全面处理；对剪刀、镊子等清洗消毒后 进行高压处理；对记录本、记号笔、垃圾桶等进行更换；同时对实验室用紫外灯照射后进行长 时间的通风换气。处理2次后，用空气沉降法和表面擦拭法取样检测，所有取样点均呈阴性， 证明实验室污染已排除3。4讨论与结论非洲猪瘟传入我国后给全国生猪产业造成严重冲击，目前我国疫情污染面广，不断有新的 疫

11、情报道，且尚无有效的商品化疫苗和有效治疗药物，因此该病防控主要依靠监测扑杀感染动 物和完善的生物安全措施。咸阳市的非洲猪瘟监测工作主要包括临床监测排查和实验室检测。临床排查尤其是养殖环节非洲猪瘟排查，是及时发现和消除风险的重要手段。全市市县乡 三级动物防疫机构兽医人员实施疫情监测排查，要求对发现的异常死亡和有可疑症状的生猪， 遵照非洲猪瘟疫情应急预案的要求，及时报告当地兽医行政主管部门、动物卫生监督机构 或动物疫病预防控制机构，并按程序逐级上报。实验室核酸检测是非洲猪瘟防控的重要环节。PCR方法灵敏性高，适用于潜伏期、感染早 期和康复期等动物体内病毒含量较低时的检测。检测结果的准确性是诊断的关键，PCR实验具 有强大的扩增能力，检测灵敏性高，因此极微量的污染都会导致假阳性或可疑结果的出现。造 成污染的原因很多，主要包括样本间的交叉污染、试剂的污染、扩增产物的污染、人员的污染、 消毒不彻底的污染等。由于本实验室自开展非洲猪瘟检测以来，从未检出核酸阳性样品，污染 源应该来自阳性对照。非洲猪瘟监测是防控工作的重要环节，临床监测必须做到及时、全面；实验室检测需确保 时效性、准确性；应做好做细试验检测的每个环节，保证实验室良好运行。以上一系列工作的 顺利开展，才能发挥疫情预测预警作用，保证