牛乳中细菌数的检查

1、欧阳家百创编牛乳中细菌数的检查欧阳家百(2021.03. 07)摘要：【目的】采用两种方法检测牛乳中细菌数目，鉴定牛乳卫 生等级。【方法】采用美蓝还原酶试验法和标准平板计数法检测 不同种类牛乳中细菌数目，确定质量等级。通过対照试验鉴定巴 斯德消毒法是否符合卫生标准。【结果】美蓝还原酶试验法可以 快捷简便地对牛乳质量等级进行定性检测；标准平板法可以对牛 乳中细菌数量进行定量检测，结果准确。【结论】通过标准平板 法平行测定，可确定样品牛乳等级为中等和差。通过对照试验， 确定巴斯德消毒法可靠性强。关键词：牛乳；美蓝还原酶；标准平板计数；细菌数；检查The Inspection of the Numb

2、er of Bacteria in MilkYongqing Xue, Wenjing Sun, Xiangchen Fan, Na Li, Junyi Li,Hongzhou Zhao,Tongyang Chen, Chunyan Hu(College of Life Sciences, ShandongAgriciitiialUniversity, Taiwan,271000, China)Abstract: ObjectiveUsing two methods to detecting the quality of cows milk and the number of bacteria

3、 in milk and to dentifying the hygienic level of milkMethods Using the methylene blue reductase method and the standard plate counting method to carry on the detection of the number of bacteria in different milk, therefore todetermine the quality of milk. Through controlled trails to determine wheth

4、er Pasteurization of milk meets the quality standards. Results Methylene blue reductase test method can be easy and quick for the qualitative detection of milk quality levels; while standard plate counting method can quantify the number of bacteria in milk and the results of the test are commonly ac

5、curateConclusion Measured by the standard plating count method, the milk samples being determined are at a middle and some even low level. By the controlled trials to determine that Pasteurization is reliable.Key words: the cows milk; the methylene blue reductase method; the standard plate counting

6、method; the numble of bacteria; inspection 1引言牛乳富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质。同时，牛乳也是 许多疾病传播的一种重要的非生命载体，富含微生物生长繁殖的 丰富营养山。从健康毋牛体内刚取出的牛奶含有少量正常的起始微 生物，在牛乳的采取、加工、分装与运输过程中，可能由于操作 不规范而使牛乳污染杂菌。由于牛乳营养丰富，其中污染的杂菌 会片夬速繁殖，饮用后对身体有极大危害。牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、美蓝还原酶试 验.检测大肠菌群和标准平板计数法，本次试验通过后两种方法 分别定性、定量检测牛乳样品的细菌数含量，同时通过对照试 验，确定在牛

7、乳消毒中被广泛应用的巴斯德消毒法的卫生标准是 否达标。2材料与方法2试验时间与地点2011年11月7日日，9号楼522试验室。2.2试验材料材料：亚奥特鲜牛奶；亚奥特纯牛奶；牛肉膏蛋白月东培养 基；试剂：美蓝溶液(1:250 000);无菌水；蒸馆水等；仪器和用具：试管，试管架，三角瓶，5mL移液枪及枪头， lmL移液枪及枪头，培养平板，高温蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅， 微波炉，显微镜，载玻片，标记笔等。2.3试验方法2.3.1牛肉膏蛋白豚培养基和无菌水的制备与灭菌制备牛肉膏蛋白月东培养基400mL,分装在两个三角瓶中；取9 支试管，每支试管加9mL蒸憎水。将牛肉膏蛋白陈培养基与装有 蒸憎水的试管

8、及21个平板一起灭菌，121C维持20mino牛肉膏蛋白月东培养基的配方(每lOOOmL)为：牛肉膏3g,蛋 白腋 10g, NaC15g,琼脂 4.4g,水 lOOOmL, pH=7.07.2。2.3.2美蓝还原酶试验法测定牛乳质量取三支无菌试管，标记为1号、2号和3号，1号试管加 入10mL亚奥特鲜牛奶，2号、3号试管分别加入10mL亚奥特纯 牛奶，1号、2号试管分别加入lmL美蓝溶液，分别加棉塞塞紧。轻轻摇动试管，置于37C水浴锅中温浴，记录开始时 间;试管在水浴锅中稳定5min后取出，轻轻摇动后再放回水 浴锅；每隔30min取出试管观察美蓝与牛乳混合液颜色变化， 直至3-6h,记录试管

9、中牛乳4/5变白时的时间。2.3.3巴氏消毒法消毒牛乳将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；取一支无菌试管，标记A,加亚奥特鲜牛奶5mL;将A试管置于80C水浴锅中，使水超过试管内牛乳液 ，保持15min,不断摇动试管使加热均匀；加热至15min时立即取出试管，用流水冲洗试管外壁， 使牛乳迅速冷却；2.3.4标准平板计数法检测牛乳中细菌数将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；取一支无菌试管，标记B,加亚奥特鲜牛奶5mL;摇匀A、B试管中牛乳，从A试管中吸取ImL牛乳用无 菌水稀释，稀释度依次为10-2, 10-3, IO，；从B试管中吸取ImL 牛乳用无菌水稀释，稀释度依次为10二

10、IO* 10-5。取21个无菌平板并标明稀释度、溶液名称(消毒前牛 乳.消毒后牛乳和无菌水)，其中分别取不同梯度的牛乳各ImL 依次注入相应标记的平板，每个梯度做三个平行；取无菌水ImL 注入平板，做三个平行；取出灭菌后的牛肉膏蛋白豚培养基，用微波炉熔化为液 体，冷却到45C左右后摇匀，向21个平板中各加15mL,静置。待平板中培养基凝固后倒置，置于37C培养箱中培养 24h;选择菌落数为30-300左右的平板计数，计算每毫升牛乳 中细菌数。3结果与分析3试验结果3.1.1美蓝还原酶试验法结果见表lo表1美蓝还原酶试验法结果Table 1 the results of methylene bl

11、ue reductase testI号试管2号试管3号试管还原时间/min95185牛乳等级差中等注：表格中“一一”表示无数据。3.1.2标准平板计数法结果见表2O表2标准平板计数法结果Table2 the results of the standard plate counting method溶液10:心104105每亳升牛乳中细菌数消毒后 牛乳1238783861012101109833消那前牛乳123无菌水123注：表格中“一一”表示未获得数据。3.2分析3.2.1美蓝还原试验法1号试管还原时间为95min,所以牛乳质量为“差” ；2号试管还原时间为185min,故牛乳质量为“中等”。

12、3号试管未加美蓝 欧阳家百创编溶液，作为观察颜色变化的对照。322标准平板计数法ImL巴氏消毒法消毒之后的牛乳中根据三个梯度测得的细菌数 为9833个/mL。说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒后才可饮用。 未经消毒的牛乳未长菌落，具体原因见讨论部分。4讨论美蓝还原酶试验法和标准平板技术法是牛乳中细菌数检测中较 为准确、直观的方法。其中，美蓝还原酶试验法可以定性检测牛 乳质量。其原理是，美蓝作为一种氧化还原指示剂，可在厌氧条 件下被还原为无色，如果牛乳中有细菌，其中的活的好氧和兼性 厌氧菌通过呼吸作用消耗氧气，造成牛乳中溶氧下降，形成厌氧 环境，氧化-还原点位降低，使美蓝还原为无色美蓝卩叫牛乳中细

13、菌数越多，呼吸作用越旺盛，消耗氧气越多，厌氧环境越严格， 还原时间越短，因此可依据还原时间的长短判断牛乳的质量等 级。目前通过美蓝还原法检测牛乳质量的一般标准是：还原时间 在30min之内的，质量为“很差”，为四级奶；还原时间为 30min-2h的，质量为“差”，为三级奶；还原时间为2-6h的，质 量为“中等”为二级奶；还原时间为6-8h的，质量为“好”为一 级奶标准平板菌落计数法是测定细菌数的经典方法，可以定量检测 牛乳中细菌数量，从而直接判断牛乳质量。该方法依据的原理是 单个细菌在合适的培养条件下可长成菌落，通过系列稀释使细菌 浓度降低，并可以充分分散为单个细菌，经合适培养后，每个细欧阳家

14、百创编欧阳家百创编菌都长成肉眼可见的菌落。待菌落长成后，通过统计菌落数并计 算每毫升牛乳中的细菌数，从而判断牛乳的质量。我国消毒牛乳 的卫生标准杲，用标准平板计数法检查，规定细菌总数小于30000 个/mL。巴斯德消毒法是牛乳进行消毒普遍采用的方法，在牛乳分装之 前消毒生奶，确保细菌相对较少，能消灭牛奶中的病原菌和有害 微生物，但不破坏牛奶的营养成分，并保持其物理性质，多用于 食品消毒，保持食品风味。巴斯德消毒法是一种温和的加热工 艺，在实际应用中加热消毒的范围较广，一般在6390C之间视消 毒时间而定，主要方法有：63C保持30min,或者是80C保持 15min, 90保持5mino本次试

15、验即验证了该消毒方法的消毒效 果，通过在80C下保持15min然后用标准平板计数法检查细菌 数，验证了巴斯德消毒法的可靠性，也说明生鲜牛乳必须经过巴 斯德消毒法才符合卫生标准的要求，才能分装、饮用。在本次试验中仍出现了一些冋题，主要表现在以下方面：第一，在美蓝还原酶试验中，未验证美蓝溶液是否变质失效。 美蓝溶液变质后可能会影响还原时间的长短，甚至无法测得实验 数据。第二，在美蓝还原酶试验中，检查美蓝是否变色的时间间隔设 定为30min,使得试验结果可能存在较大误差。但缩短时间后，就 意味着需要频繁取出试管，对温水浴效果有影响。根据本次试验 的结果，在尽量缩小误差且不影响温水浴效果的前提下，建议

16、将 时间间隔缩短为15mino由于时间原因，本次试验并未验证15min欧阳家百创编的时间间隔杲否确实符合试验要求。第三，在标准平板计数法测细菌数试验中，在试验设计初，没 有设置空白对照，即用ImL无菌水代替消毒后和消毒前的牛乳， 加15mL左右牛肉膏蛋白豚培养基，在相同条件下培养，进行菌落 计数。只有通过空白对照试验，才能确定无菌水.培养基、操作 过程、操作中使用的仪器是否染菌，是否对试验结果有影响。根 据严格的试验要求，应设置该对照试验，并且只有在对照组中严 格不长菌落的前提下才能确保整个操作过程属于无菌操作。第四，在标准平板计数法测定细菌数试验中，在试验设计初， 未消毒牛乳细菌数测定时，每

17、个稀释度牛乳稀释液的总量是 5mL,使得后续操作中用移液枪无法吸出lmL稀释液。为确保试 验有序进行，每个试管中稀释液总量应该是10mLo第五，在标准平板计数法测定细菌数试验中，消毒后的牛乳在 进行计数时发现平板上没有长菌。培养平板不长菌的可能原因 有：(1)培养基种类不适合对应菌种的生长；(2)培养基配置 过程中出现冋题，如配料变质.配料用量错误、没有调节合适的 pH; (3)培养条件不适合菌种生长，如培养温度、培养时间；(4)操作中酒精误入培养基，使菌种致死；(5)在加入培养基 时，没有冷却到45乜左右，培养基温度过高，导致菌种死亡；(6)含菌样品的冋题，比如样品无菌、样品细菌浓度低而稀释

18、度 过大。在本次试验中可能成立的原因为琼脂变质、pH调节不准 确、加培养基时温度过高。可以通过重复试验、对照试验、显微 镜检查来确定具体原因。由于时间关系，本次试验未进一步确定欧阳家百创编原因。第六，在进行菌落计数前没有对培养平板进行拍照，使得试验 数据可信度降低。对试验结果进行拍照，一方廂可以保留试验初 始数据，号一方可以作为试验结果存在的证明。由于以上问题的存在，在严格意义上讲，本次试验是失败的。 通过对试验数据的分析，可初步确定本次试验的试验结果是合理 的，能够初步达到目的。5结论美蓝还原酶试验法和标准平板技术法都可以用作牛乳中细菌数 的检测。美蓝还原酶试验法操作简便，对仪器和设备要求低，出 现结果所需时间短，可定性检测牛乳质量。标准平板计数法所需试验周期长，对仪器设备要求高，操作相 对复杂，但可以定量检测牛乳中细菌数目，而且可以设置多组平 行，具有较高的重复性，提高检测准确度。牛乳因其富含蛋白质且容易吸收而被人们食用，但也正是因为 牛乳营养丰