感染HSV-1后认知功能障碍小鼠海马组织细胞周期素依赖性蛋

1、感染HSV-1后认知功能障碍小鼠海马组织细胞周期素依赖性蛋白激酶5的表达变化赵春梅1,刘 强1 ,王振海2.3(750004 银川,宁夏医科大学：临床医学院神经病学系1，总医院神经内科2； 750004银川，宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室3)摘要 目的：探讨单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus-1 HSV-1摘要和正文中第一次出现英文缩写请注明中英文全称)感染后认知功能障碍小鼠海马组织中细胞周期素依赖性蛋白激酶5( Cyclin-dependent protein kinase 5 CDK5) 及其激活因子p35/p25结果中未提到p35?的表达变化及可能的作用。方法：

2、雄性C57BL/6小鼠100只，分随机如何随机？请指明具体的随机方法，如果是随便分的，请删除随机二字法分为正常组、模型组、假手术组。采用颅内注射法建立单纯疱疹病毒性脑炎小鼠模型，感染后20 d Morris水迷宫评价认知功能，应用RT-PCR方法检测小鼠海马组织CDK5 mRNA的相对表达，Western blot方法检测CDK5及其激活因子p35/p25的蛋白表达。结果：水迷宫实验模型组小鼠与正常组逃避潜伏期9.83.3s，假手术组11.75.4s,模型组26.916.4s及假手术组比较，提示模型组小鼠学习记忆能力受损明显请补充主要的潜伏期数据，以均数加减标准差形式表示，；模型组小鼠海马组织

3、CDK5 mRNA的相对表达量为2.220.92，较正常组(1.250.13)及假手术组(1.370.39)明显上调(P0.05)，；模型组海马组织CDK5蛋白表达比值CDK5（1.220.40），p35（1.700.81），和p25蛋白（1.130.39），与正常组及假手术组比较，表达明显增高，差异有统计学意义（P0.0105）。请补充主要数据，以均数加减标准差形式表示结论：CDK5有可能参与了单纯疱疹病毒性脑炎小鼠认知功能障碍的发生。摘要和正文中第一次出现英文缩写请注明中英文全称结果中未提到p35?如何随机？请指明具体的随机方法，如果是随便分的，请删除随机二字请补充主要的潜伏期数据，以均数

4、加减标准差形式表示请补充主要数据，以均数加减标准差形式表示关键词 单纯疱疹病毒性脑炎；认知功能障碍；细胞周期素依赖性蛋白激酶5；p25The Expression of CDK5 in Hippocampal Tissue of Mice Cognitive Outcome Following Herpes Simplex Virus EncephalitisZhao Chunmei1 Liu Qiang1 Wang Zhenhai2.31.Neurology Department of Clinical Medicine College，Ningxia Medical University，

5、Yinchuan 750004，China；2. Department of Neurology, Union Hospital，Ningxia medical university，Yinchuan 750004，China；3.Key Laboratory of Brain Disease Research of Ningxia，Yinchuan 750004，ChinaAbstract Objective To investigate the change of the expression and possible effectof cyclin-dependent protein k

6、inase 5(CDK5) in hippocampal tissue of mice with cognitive outcome following herpes simplex virus encephalitis. Methods One hundred male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups: the model group,the sham-operated group and the normal group. Herpes simplex virus encephalitis mice model wa

7、s made by Intracerebral inoculation. The behavioral tests were done respectively at 20 days after inoculation. CDK5 mRNA were examined by RT-PCR. Western blot was used to evaluate CDK5 and its activator p25 protein expression.Results The ability of learning and memory of model group was damaged sign

8、ificantly(P0.05) compared with the sham-operated group and normal group.The expression of CDK5 mRNA in model group was higher than that of the sham-operated group and the normal group. The level of CDK5 and p25 protein in model group was increased respectively compared to sham-operated group and the

9、 normal group and there was a significant difference (P0.01).Conclusion CDK5 was involved in the cognitive outcome of mice with herpes simplex virus encephalitis.Key words Herpes simplex virus encephalitis；Cognitive deficits；CDK5；p25 Supported by the Chunhui Program of Ministry of Education of China

10、 (Z-2008-1-75002); Supported by the Open Project from doctoral degree built disciplines of Ningxia Medical University (KF2010-34 ); Supported by the General Program of Ningxia Medical University（XM200954）.Corresponding author: Wang Zhenhai，E-mail: HYPERLINK mailto:基金项目 教育部春晖计划资助项目（Z-2008-1-75002）；宁夏

11、医科大学“博士学位建设学科”开放课题（KF2010-34）；宁夏医科大学面上项目（XM200954）通信作者 王振海， E-mail: HYPERLINK mailto:单纯疱疹病毒性脑炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）病理上又称急性出血坏死性脑炎，在散发性病毒性脑炎中是最常见的一种类型。有研究发现约90%左右的HSE患者有精神障碍症状，其中约75%的患者存在不同程度的认知功能障碍 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 11 。其具体机理尚未研究清楚。有报道认为，细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin dependent prote

12、in kinase 5, CDK5)参与了多种神经退行性疾病的发生 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 2, 32,这些疾病均有认知功能障碍的症状。国内学者行动物实验证实CDK5参与了血管性痴呆的发生 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 43。本研究应用RT-PCR及Western blot方法检测HSV-1摘要和正文中第一次出现英文缩写请注明中英文全称感染后认知功能障碍小鼠海马组织中CDK5的表达变化，为探讨CDK5在HSV-1感染后小鼠认知功能障碍发生中的作用提供实验依据。摘要和正文中第一次出现英文缩写请注明中英文全称1 材料和方法1.1材料1.1.1实验动

13、物与分组 依据文献 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 54选择4周龄雄性C57BL/6小鼠100只，体质量(11.351.34)g,宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（宁）2005-0001。将小鼠随机如何随机？请指明具体的随机方法，如果是随便分的，请删除随机二字分为模型组（84只）、假手术组（8只）、正常组（8只）。造模前先行Morris水迷宫检测以剔除先天愚钝小鼠。如何随机？请指明具体的随机方法，如果是随便分的，请删除随机二字1.1.2病毒株及动物模型的制备 HSV-1-F株由华中科技大学同济医学院梅元武教授馈赠。将HSV-1-F在VERO细胞中培养48 h

14、，当有50%的VERO细胞产生变大、变圆或融合性病变时 ,收集病毒，并测定该病毒滴度为TCID5010-5。采用颅内注射法 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 5建立动物模型，模型组接种病毒滴度为TCID5010-4），假手术组同法给予等量生理盐水注射，正常对照组不予处理。1.1.3主要试剂和仪器 引物根据GenBank提供的模板，由上海生物工程技术公司合成。HSV-1-F株上游：5-ATCCGAACGCAGCCCCGATG-3，下游：5-TCTCCGTCCAGTCGTTTATCTT-3，扩增片段长度142bp，退火温度63 ；小鼠CDK5，上游：5-GGACACCGACTGA

15、GGAACAATGGC-3，下游：5-TGGCATTGAGCTTGGGCACGAC-3，扩增片段长度：114bp，退火温度57；-actin上游：5-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3，下游：5-ATGTCACGCACGATTTCCC-3，扩增产物长度263bp。请单独生成一段 “1.1.4 引物序列”CDK5（C-8）抗体和p35/p25（C-19）抗体均购于Santa Cruz 公司，DNA提取试剂盒（Promega），RNA提取试剂盒（Omega），RT-PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，全蛋白提取试剂盒（凯基），BCA蛋白浓度测定试剂盒、HRP标记抗体二抗、-act

16、in（北京博奥森），Western一抗、二抗去除液（碧云天）， PVDF膜（Millipore公司）,Morris水迷宫跟踪系统（成都泰盟科技有限公司）,DYY-6D型电泳仪 (北京六一仪器厂),PCR扩增仪(美国Bio-Rad DNA Engine),PowerPAC 200电泳仪及配套电泳槽、凝胶成像仪（Bio-Rad请单独生成一段 “1.1.4 引物序列”1.1.4引物序列 引物根据GenBank提供的模板，由上海生物工程技术公司合成。HSV-1-F株上游：5-ATCCGAACGCAGCCCCGATG-3，下游：5-TCTCCGTCCAGTCGTTTATCTT-3，扩增片段长度142bp

17、，退火温度63 ；小鼠CDK5，上游：5-GGACACCGACTGAGGAACAATGGC-3，下游：5-3，扩增片段长度：114bp，退火温度57；-actin上游：5-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3，下游：5-ATGTCACGCACGATTTCCC-3，扩增产物长度263bp。请单独生成一段 请单独生成一段 “1.1.4 引物序列”1.2方法1.2.1 验证造模成功 病理学检查及HSV-1 DNA片段的PCR的检测。1.2.2 存活状态观察及Morris水迷宫实验 接种后密切观察记录各组小鼠存活状态。于接种后20d进行Morris水迷宫实验测试各组小鼠空间学习记忆能力，评价认

18、知功能1.2.3 标本制备 Morris水迷宫实验结束后，将各组小鼠冰浴后迅速断头取出整个脑组织,冰上取海马，迅速入液氮至少30min，之后置-801.2.4 RT-PCR检测CDK5 mRNA表达 将冻存的海马组织研磨，按照试剂盒说明书操作,提取总RNA，并检测其总RNA的完整性。之后按试剂盒说明书操作进行反转录，获取cDNA，以反转录所得cDNA为模板进行PCR扩增。总体系25l，cDNA模板2l，上下引物各0.5l，2EasyTaq PCR SuperMix 12.5l，RNase-free water定容至25l。反应条件为：50 2 min、95 10 min、95 15 s、60

19、30 s、72 30 s, 34个循环后72 延伸71.2.5 Western blot 检测CDK5及其激活因子p35/p25的蛋白表达 将冻存的海马组织研磨，按总蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。以12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜，室温下室温多少（2225）5%牛奶封闭液封闭1 h，加入用封闭液稀释的单克隆抗体一抗（-actin，1：500）和多克隆抗体（CDK5，C-8，1：500稀释），4孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗（1：10 000稀释）反应2 h，ECL 显影。-actin作为内参照。然后用一抗、二抗洗脱液洗膜，再加入用封闭液

20、稀释的多克隆抗体一抗（p35/p25，C-19，1：500稀释）。实验重复3次，凝胶成像仪获取图像，进行点密度分析。室温多少1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件进行分析，所有数据进行正态性检验，计量资料以s表示，行单因素方差分析，组间的两两比较采用LSD-t检验。2结果2.1 HSE小鼠模型建立模型组小鼠接种后35d开始陆续出现精神萎靡、进食减少、体质量增长慢、毛发紊乱等症状，57d时症状最为明显，发病达高峰。模型组83只（筛除了1只）小鼠，死亡42只，死亡率50.6%。正常组及假手术组小鼠存活状态未见异常。接种后第5天观察各组小鼠体质量增长情况，正常组为(0.420.89)g，假

21、手术组为(0.280.63)g，模型组为 -(2.11.55)g，模型组与假手术组、正常组之间比较，差异有统计学意义（P0.05）。2.2缺小标题 病理检查结果缺小标题各组分别取出两只小鼠行病理检查，结果病理检测提示模型组小鼠脑组织明显炎性改变: 脑实质内炎细胞浸润、神经细胞空泡样变性、坏死，围血管淋巴细胞聚集等（图1），HSV-1DNA片段PCR检测，模型组小鼠可见142 bp阳性扩增条带,假手术组和正常组未见此扩增条带(图2)。再单独成一段 “2.3 PCR检测各组再单独成一段 “2.3 PCR检测各组”图1模型组小鼠脑组织炎性改变（HE400）2.3 PCR检测HSV-1 DNA结果 H

22、SV-1DNA片段PCR检测，模型组小鼠可见142 bp阳性扩增条带,假手术组和正常组未见此扩增条带(图2)。再单独成一段 “2.3 PCR检测各组再单独成一段 “2.3 PCR检测各组”M: 标准；1：正常组；2 、3：假手术组；4 、 5：模型组 图2 各组小鼠脑组织HSV-1 PCR检测结果2.2 4 Morris水迷宫测试结果初筛实验第5五天实验结果用day0表示。造模结束后再次行水迷宫实验5 d，记为day1day5。见表1。请对表1的结果作一简单的统计学描述，如第几天时，组与组比较有统计学差异（P0.05）造模前初筛实验第5天三组比较无统计学差异（P0.05），造模后第5天模型组与

23、正常组及假手术组比较有统计学差异（请对表1的结果作一简单的统计学描述，如第几天时，组与组比较有统计学差异（P0.05）表1 HSV-1感染前后小鼠空间学习记忆变化(s,s)组别不同时间点定位航行逃避潜伏期(s)Day0Day1Day2Day3Day4Day5正常组(n=6)12.26.832.26.212.74.414.53.713.05.59.83.3a假手术组(n=6)15.58.239.426.425.113.119.613.619.213.511.75.4a模型组(n=36)13.55.062.218.827.917.326.818.341.430.626.916.4F值0.4042.

24、5001.9381.3903.1164.401P值0.6730.1040.1670.2690.0630.024a: P0.05，与模型组比较2.3 5 RNA纯度及完整性检测结果 对各组标本总RNA进行光密度OD值测定，其A260D（260）/ D（280）值均介于1.82.0之间，说明RNA纯度较好。同时对其进行1%琼脂糖电泳，凝胶成像系统中观察可见28S、18S、5S 3条清晰电泳条带，证明RNA完整性较好（图3）。图？图？图3 RNA完整性检测2.4 6 RT-PCR 检测CDK5 mRNA结果正常组（n=6）、假手术组（n=6）、模型组（n=30）小鼠海马组织均存在114bp的CDK5

25、基因片段和263bp的-actin片段（图6图序有误4)。凝胶成像仪获取图像后Quantity One软件分析，结果各组CDK5基因片段的相对灰度值分别为正常组（1.250.13）、假手术组（1.370.39）、模型组（2.220.92），两两比较LSD-t检验提示模型组CDK5 mRNA的相对表达量与假手术组、正常组之间差异有统计学意义（P0.05），假手术组与正常组之间差异无统计学意义（P0.05）。图序有误1-5：模型组；6-8：正常组；9-11：假手术组；M：标准图3请在图旁标识出目的基因和看家基因4各组小鼠CDK5基因扩增产物电泳图请在图旁标识出目的基因和看家基因2.5 7 West

26、ern blot 检测CDK5及其激活因子p35/p25结果中未提到p35?蛋白表达结果 结果中未提到p35?经点密度分析发现模型组CDK5表达和p35/p25蛋白表达较假手术组和正常组均显著增高，差异有统计学意义（P0.0105）。见表3，图4、5、图6。表3 2 各组小鼠海马组织CDK5、p25 Western蛋白表达比值的比较(s)组别n(只)CDK5p35p25正常组60.520.07a0.800.250.670.14a假手术组60.610.12a0.890.260.730.12a模型组301.220.401.700.811.130.39a P0.01,与模型组比较 1，2：模型组；3

27、，4：正常组；5，6：假手术组图45 Western blot 检测CDK5蛋白的表达1，2：模型组；3，4：正常组；5，6：假手术组 图56 Western blot 检测p35/p25蛋白的表达3 讨论HSE年发病率为23人/10万23万/10万？，自然死亡率高，存活者有不同程度的后遗症，只有2.5%左右的患者能完全康复 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 66。因主要损害额叶、颞叶及边缘系统，故精神障碍（主要表现为认知功能障碍）、癫痫等等是HSE最常见的后遗症，可出现在疾病的各个时期。本实验成功建立了HSE动物模型，通过水迷宫实验证实了HSV-1感染后小鼠的认知功能明显受

28、损。23万/10万？CDK5与神经系统的发育、神经元正常功能的维持关系密切，参与神经系统发育过程中神经元的迁移、神经突起的生长、轴突运输、胞吐、药物成瘾等 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 7, 87。单体形式存在的CDK5没有激酶活性，当与激活因子p35或p39结合之后才表现出激酶活性。这两种激活因子主要分布于神经元细胞系，因此CDK5的活性几乎完全限制在神经系统内 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 98。CDK5及其激活因子可能是诱导神经元损失的关键分子之一 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 10。P35在钙蛋白酶的作用下生成p25，p

29、25CDK5是激酶活性存在的主要形式 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 11, 129。CDK5参与了多种神经系统疾病的发生，这些疾病均有不同程度的认知功能损害症状。然而，HSE认知功能障碍的发生是否有CDK5的参与尚不清楚。本研究中，模型组小鼠接种HSV-1后，表现出精神萎靡、进食减少、体重增长慢、毛发紊乱,严重者步态不稳或抽搐等；随机抽样脑组织病理检查可见脑实质内大范围的炎细胞浸润、神经细胞空泡样变性、坏死，围血管淋巴细胞聚集等；HSV-1 DNA PCR检测可见特异性扩增条带，证实动物模型建立成功。水迷宫初筛实验结果提示3组小鼠逃避潜伏期无统计学差异（P0.05），造模

30、成功后再次行水迷宫实验，模型组小鼠与假手术组及正常组对比，逃避潜伏期明显延长，有统计学差异（P0.05），假手术组与正常组对比无统计学差异（P0.05），提示模型组小鼠接种了HSV-1后出现了空间学习记忆障碍，存在认知功能障碍。在此基础上，应用RT-PCR方法检测各组小鼠海马组织中CDK5 mRNA的相对表达量，模型组高于假手术组及正常组，有统计学差异（P0.05），假手术组与正常组对比无统计学差异（P0.05），排除了颅内注射过程中机械损伤对CDK5表达的影响。Western blot 检测CDK5及其激活因子p35/p25蛋白表达，结果模型组蛋白表达比值CDK5(点密度值分别升高1.220

31、.40)、p35（1.700.81）、P25(倍和1.130.39倍建议与表3一致，采用蛋白表达比值的说法)，与正常组CDK5(0.520.07)、p35（0.800.25）、P25(0.670.14)及假手术组CDK5(0.610.12)、p35（0.890.26）、P25（0.730.12）比较，差异与假手术组及正常组比较，有统计学差异意义（P0.01）。提示HSV-1感染后认知功能障碍小鼠海马组织CDK5的表达明显上调。推测CDK5有可能参与了HSE小鼠认知功能障碍的发生机制。 建议与表3一致，采用蛋白表达比值的说法综上所述，CDK5可能参与了HSE认知功能障碍的发生，文献 ADDIN

32、KyMedRef2008REF:REF 1310报道参与影响中枢神经认知功能的因子 ADDIN KyMedRef2008REF:REF 10很多，CDK5是否参与了共同的信号通路有待进一步研究。本研究建立HSE动物模型来初步探讨CDK5与HSE认知功能障碍的相关性，为探索HSE认知功能障碍的发病机制和探讨新的药物治疗靶点提供了依据。 ADDIN KyMedRef2008REF:DOC 参考文献1Hokkanen L, Launes J. Neuropsychological sequelae of acute-onset sporadic viral encephalitisJ. Neurop

33、sychol Rehabil, 2007,17(4-5):450-477.2Dhariwala FA, Rajadhyaksha MS. An unusual member of the Cdk family: Cdk5J. Cell Mol Neurobiol, 2008,28(3):351-369.3Cheung ZH, Fu AK, Ip NY. Synaptic roles of Cdk5: implications in higher cognitive functions and neurodegenerative diseasesJ. Neuron, 2006,50(1):13-

34、18.4王天俊, 吕佩源, 王贺波, 等. 卡配因I-细胞周期依赖性蛋白激酶5通路在血管性痴呆小鼠海马中的变化J. 中国老年学杂志, 2009,29(18):2337-2340.5李爱萍, 赵慧, 李韶, 等. 不同鼠种在Morris水迷宫学习记忆行为中的种属差异J. 中国行为医学科学, 2005,14(1):29-31.6赵高年, 谢鹏. 甘草甜素抗单纯疱疹病毒I的实验研究J. 蛇志, 2008,20(3):182-184.7Kim SH, Ryan TA. CDK5 serves as a major control point in neurotransmitter releaseJ.

35、Neuron, 2010,67(5):797-809.8Jessberger S, Gage FH, Eisch AJ, Lagace DC. Making a neuron: Cdk5 in embryonic and adult neurogenesisJ. Trends Neurosci, 2009,32(11):575-582.9Angelo M, Plattner F, Giese KP. Cyclin-dependent kinase 5 in synaptic plasticity, learning and memoryJ. J Neurochem, 2006,99(2):35

36、3-370.10佘飞, 张彦文, 李丽, 等. 电磁辐射对原代大鼠皮层神经元细胞周期素依赖性蛋白激酶5及其活化亚基的影响J. 第三军医大学学报, 2010,32(22):2374-2377.11Lee MS, Kwon YT, Li M, et al. Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpainJ. Nature, 2000,405(6784):360-364.12Cagnon L, Braissant O. Role of caspases, calpain and cdk5 in ammonia-induced cell death in developing brain cells