实验技术原理

1、WesternBlot原理、显色分类及操作步骤一、 原理与Southern或NorthernWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物WesternBlot原理、显色分类及操作步骤一、 原理与Southern或NorthernWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白探针”是显色”用标记的二抗可以定性又可以半定量的 Western 是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法western 显色的方法主要有以下几种底物化学发光底物荧光DAB现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB文章通常是用底物化学发光 ECL盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记+

2、，如遇到HRP，即发光，可使胶二、操作步骤(一配分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP TEMED 外液 3 分钟10%AP（0.70.8:100, AP 浓度越低，15%的分离0.5:100）TEMED（0.4:1000, 15%0.3:1000，浓缩2、封胶2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%0.1%SDS封，浓度10%0.1%SDS。封胶后切记，ddH2O冲洗干净，然后加少量 0.1%的 SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉 SDS，将玻3、灌好浓缩胶后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形拨出梳子后用 ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶

3、随后用 SDS (二) 样品处1培养的细胞（定性去培养液后用温的PBS23遍（冷的PBS有可能使细胞脱落200300l(二) 样品处1培养的细胞（定性去培养液后用温的PBS23遍（冷的PBS有可能使细胞脱落200300l，60801loading buffer100，1min用细胞刮刮下细胞后在EP10min，期间vortex 23EP 01400016000g 2min，再次挑丝。若无团块也1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，2培养的细胞（定量 去培养液后用温的PBS23遍（冷的PBS有可能使细胞脱落1020min用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100200w）3s，212000g离

4、心，4，2min。将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer4 12 98，3min。3 50100mg 1ml 1ml 12000g离心，4，2min。loadingbuffer12 98，3min。(裂解液配方：Tris-Cl 议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM 及NaF 25mM1loadingbuffer配方：10% 甘油，50mMTrisCl6.8)，2% -10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用 5%的SDS，肝肾等组织 2%即可。(三) 电所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的 1loading buffer

5、上样，Marker 1loading buffer 调整至与样品等体积。45V 65V 时改为稳压1cm glycine0.1% SDS（10ml10%glycine0.1% SDS（5ml10%(四) 转120湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4gM-OH 200ml1,000ml50ml 180ulNC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水(四) 转120湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4gM-OH 200ml1,000ml50ml 180ulNC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中 10min 以排除气

6、泡，随后浸泡入转移液中。PVDF 膜则在M-OH 中浸泡 20min的过多部分（尤其是干转，以防止短路温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流 100mA 过夜，或 400mA，4h。注意不同1-21V/cm2Tris-baseglycine200ml 甲醇(五1PBST或TTBS的水溶液TTBS 将239cm2 2ml闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室3一抗孵育结束后，用PBST或TTBS5-10min。 （1:10001:100005二抗孵育结束后，用PBST或TTBS5-10minPBST：TTBS：Tris-7.40.01% 5%脱脂奶粉的PBST或TTBS

7、200ml TTBS10g(六) 发光鉴HRP-ECL发TTBS10g(六) 发光鉴HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP 显1HRP-ECL 发光法将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，A、B 混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min 左右）后滤。取出胶片立即完全浸入显影液中 1-2min2AP-NBT/BICP 显色法：每片NBT/BICP30ml30EP管中，39cm 1ml 即可。将PBST 或TTBS 洗涤过的膜用去离子NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）20s 10s 观察一次，至条带明显或有本底出现将膜在PBST或TTBS30min2次液。4060min1h。37 1h PBST或TTBS20min2次液。二抗杂交，37 1h。PBST或TTBS20min2次液。PBST或TTBS20min2次液。 10三抗杂交，室温 1h。37 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗11PBST 或TTBS 20min2 次液。120.2% 42（(七NCNC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七增强敏感性”