血红蛋白提取和分离经典

1、关于血红蛋白的提取和分离经典第一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月氨基酸的结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH第二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月氨基酸的结合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH第三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月氨基酸的结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽键脱水缩合第四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月氨基酸的结合方式:脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O第五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月氨基酸的结合方式:

2、脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三肽以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。H2O第六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）第七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋白质结构的

3、多样性第八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成 _个肽键,脱去_个水分子，至有氨基和 羧基各 _个11、相关计算n - mn - mm第九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构第十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月关于蛋白质相

4、对分子量的计算： n 个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为_n a - (n - m) 18第十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月血红蛋白第十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月思考1 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考2 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。第十五张，PPT

5、共九十三页，创作于2022年6月 本课题学习目标 体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点： 样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。第十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月1、凝胶色谱法 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析 。 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，

6、例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等 一、基本概念及原理第十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。第十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程第十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第二十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第二十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月二

7、、缓冲溶液 在一定范围内，能够抵制 对溶液PH值的影响，维持PH 不变。1.作用:2.配制: 通常由 溶解于水中配制而成。调节缓冲剂 的就可以制得在 使用的缓冲液。 3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_ ,其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)磷酸缓冲液外界的酸和碱基本12 种缓冲剂使用比例不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3第二十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月三、 电泳血红蛋白的分离鉴定方法1.概念：带电粒子在 作用下发生 的过程。

8、2.原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上 或 。在电场的作用下，这些带电分子会向着的 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场迁移可解离正电负电与其所带电荷相反带电性质的差异大小形状迁移速度第二十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和

9、小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第二十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图第二十五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月迷你双垂直电泳槽等电聚焦多用电泳槽卧式电泳槽电泳槽9第二十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 （1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（ ）。分子的大小S

10、DS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）第二十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图（A为正面，B为剖面）1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.73：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.310第二十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。第二十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法

11、的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确 【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。A第三十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月二、实验步骤 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理粗分离纯化纯度鉴定（电泳）第三十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯化：纯度鉴定透析去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质SDS-聚丙烯酰

12、胺凝胶电泳第三十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月血液血浆水 分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细 胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90）两个肽链两个一肽链四个亚铁红素基团2. 血液有哪些成分？ 1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白第三十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第三十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月血红蛋白两个肽链两个一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基

13、团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：第三十五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）第三十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间五倍体积的生理盐水三次 上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。第三十七张，PPT共九十三页，创

14、作于2022年6月初次离心后的结果3次洗涤后的结果第三十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（2）释放血红蛋白思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂第三十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月磁力搅拌器第四十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月搅拌器转子第四十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月搅拌器正在工作第四十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（3）分

15、离血红蛋白溶液： 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。第四十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次第四十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月柜式离心机第四十五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 2.粗分离透析（去除分子量较小的杂质）（1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成，常用 。将透析袋放入 溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是 。 透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜 透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质磷

16、酸缓冲第四十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第四十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月透析过程动画演示第四十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（1）凝胶色谱柱的制作 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。3、纯化（凝胶色谱）去除相对分子量较大的杂质蛋白 第四十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月凝胶色谱柱的制作第五十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（2）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮

17、液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第五十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离

18、的效果。思考第五十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月装配好的凝胶柱第五十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月(3）样品加入与洗脱加样前 打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面第五十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。加透析样品第五十五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第五十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第五十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打

19、装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？第五十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月3.样品的加入和洗脱 1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集缓冲液凝胶第五十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：加到色谱柱的（ ）样品渗入凝胶床：（ ）再调整缓冲液面洗脱：收集：待（ ）接近色谱柱底端时收集顶端样品完全进凝胶层红色的蛋白质色谱柱制作成功的标志： 红色区带均匀一致的移动记第

20、六十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月4、纯度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）第六十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（1）、 胶板的制备： .将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 .把玻璃板在灌胶支架上固定好第六十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（2）、分离胶的制备：按下表制备分离胶(T=12%,pH=8.8)试剂 双蒸水 分离胶缓冲液 丙胶贮液 Ap TEMED用量 1.65mL 1.3mL 2.0mL 0.05mL 0.002mL胶灌至距梳子

21、齿下端1cm灌毕封上一层水当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。第六十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（3）、 浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.8)试剂 双蒸水 浓缩胶缓冲液 丙胶贮液 Ap TEMED用量 1.46mL 0.25mL 0.27mL 0.02mL 0.002mL用滤纸吸干水倒入浓缩胶插入梳子聚合。第六十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（4）、取样 取纯化后的血红蛋白样品10 L加入10 L上样buffer（内含少许溴酚蓝的40蔗糖 ）混匀。第六十五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（5）装槽、点样： 拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上

22、（凹板一侧向内） 在电泳槽中加入缓冲液 点样。第六十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月第六十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（6）电泳：第六十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月（7)、剥胶、染色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。第六十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月(8)、结果第七十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼

23、吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳第七十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月影响蛋白质分子运动速度的因素第七十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红

24、蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。第七十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月【典例2】(2011扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：第七十四张，PPT共九十三页，创作于20

25、22年6月(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。(3)甲装置用于_ ，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_-_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。运输磷酸缓冲液洗脱血红蛋白透析(粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小红色的蛋白质接近色谱柱底端第七十五张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果

26、分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或

27、是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 第七十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？第七十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月教学反馈 1凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵

28、制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白BBBA第七十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中

29、的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物CDC第七十九张，PPT共九十三页，创作于2022年6月1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质第八十张，PPT共九十三页，创作于2022年6月2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分

30、子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较第八十一张，PPT共九十三页，创作于2022年6月3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固第八十二张，PPT共九十三页，创作于2022年6月6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂脂类物质血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀第八十三张，PPT共九十三页，创作于2022年6月1.答:凝胶色谱法也称为分配色谱法

31、,它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一.所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体,这些小球体大多数是由多糖类化合物构成,小球体内部有许多贯穿的通道,当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时,各分子在色谱柱内进行两种不同的运动,即垂直向下的运动和无规则的扩散运动. 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢.因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,这种现象又叫分子筛现象.1.凝胶色谱法分离蛋白质

32、的的原理是怎样的?课后练习第八十四张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 答:在一定范围内,能对抗外来少量强酸,强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液.缓冲溶液通常是由一或两种缓冲剂溶解于水中制得,调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液. 缓冲溶液的作用维持反应体系的pH不变.在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的,受到氢离子浓度的严格调控.为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境,就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH.2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?第八十五张，PPT共九十三页，创作

33、于2022年6月原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.许多重要的生物大分子,如氨基酸,多肽,蛋白质,核苷酸,核酸等都具有可解离基团,它们在某个特定的pH下会带上正电或负电;在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动.作用：电泳技术就是在电场的作用下,利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而达到对样品进行分离,鉴定或提纯的目的.3.电泳的作用及其原理是什么?第八十六张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 答:血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括:样品处理,粗分离,纯化和纯度鉴定.首先通过洗

34、涤红细胞,血红蛋白的释放,离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定. 答:血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?第八十七张，PPT共九十三页，创作于2022年6月3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1

35、.目的： 丙烯酰胺和N, N-亚甲基双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-亚甲基双丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。Tris甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。样品处理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。染色液： 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。第八十八张，PPT共九十三页，创作于2022年6月 SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0