不同树龄苹果园土壤对苹果砧木的抑制作用及与土壤微生物群落的相关关系研究

1、不同树龄苹果园土壤对苹果砧木的抑制作用及与土壤微生物群落的相关关系研究论文导读:：本研究以平顶海棠苹果砧木为试验材料，以采集自清苑县4个不同树龄苹果园的土壤为对象，研究了不同树龄苹果园土壤对再植平顶海棠幼苗生长的影响。结果说明，在前茬树龄为3、8、15和24年苹果园土种植的平顶海棠幼苗比正茬土对照的平均株高分别减少31.22%、46.38%、57.66%和63.10%；再植平顶海棠幼苗地上部干重分别减少0.96%、57.58%、76.88%和78.10%；地下部干重分别减少40.38%、48.79%、64.03%和79.43%。在24年生苹果树土壤中再植海棠幼苗校正发病率到达了72.73%，而

2、在3年生苹果树的土壤中再植海棠幼苗校正发病率只有18.18%。用16S rDNA 和18S rDNA特异引物，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增，通过变性梯度凝胶电泳DGGE对不同树龄的苹果园土壤根际细菌和真菌群落结构的差异进行分析。结果说明，随着苹果树龄的提高，根际土壤中真菌种类和数量显著增加，而细菌的种类和数量那么随着树龄的增加显著减少。论文关键词：苹果再植病害，根际微生物，树龄，变性梯度凝胶电泳据统计，2021年我国苹果种植面积为199.23万hm2，产量为2984.7万t，占世界苹果面积和产量的40%以上，居世界第一位【1】。由于很多主产区大局部耕地都栽植了苹果，很难在新区域开展果树

3、种植，苹果再植问题严重困扰着我国苹果主产区果业的可持续开展。以河北省为例农业论文，本研究组在2007和2021年调查发现，树龄在15年以上的苹果园已占到近70%，而苹果最正确的结果年龄一般不超过20年，说明果园更新换代问题已经非常紧迫。苹果树再植病Apple replant disease，ARD又称连作障碍或忌地现象，有的也叫再植障碍，得病植株表现为树势弱、叶片小、新梢细短、根系腐烂、根量减少、果实质量差等病症。据报道，果树再植病主要是由于土壤残毒、线虫、土壤根际有害微生物等影响造成【2】。再植病害病因复杂，但众多的研究报道认为，土壤微生物对果树再植病害的发生发挥着重要作用【6】论文开题报告

4、范例。变性梯度凝胶电泳denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE最早是一项用于DNA突变检测的电泳技术【7】，近些年来已经被广泛应用于各种环境微生物的生态研究中，如高热温泉、湖泊、海洋、土壤和根际等。本文首先研究了随着苹果种植年限的延长，其根际土壤对于后茬再植平顶海棠幼苗的株高、生物量、发病率和病原真菌数量的影响农业论文，然后采用PCR-DGGE技术，以不同树龄苹果园土壤样品中土壤微生物的基因组总DNA为研究对象，通过比拟土壤中原核微生物的16S rDNA和真核微生物的18S rDNA差异，研究了随着苹果树龄的增加土壤中微生物群落多样性的变化情况。

5、1 材料与方法1.1 实验材料：花盆10 x12 cm；海棠品种：平顶海棠(Malus robust Rehd.)1.3 土样采集和处理设置：土壤采集于河北省清苑县温仁村红富士苹果园，采集果园的树龄分别为3、8、15和24年。砧木为八棱海棠Malus micromalus Makino)，土壤类型为黄褐土。对照土采集于苹果园附近未种植过果树的麦田。果园土样采集距苹果树干1.5 m，深10-30 cm范围内的根际土壤，五点随机取样农业论文，混匀、过筛，备用。对不同树龄果园土壤的肥力测定结果说明，土壤肥力与苹果树龄间没有明显相关性表1。将不同树龄苹果园土壤及对照土壤分装于直径12 cm花盆中，每盆

6、装土1 kg。将在培养室中培养4周的平顶海棠幼苗移栽于不同处理的花盆中。每个处理4次重复，每6株幼苗作为一个重复论文开题报告范例。1.4 土壤微生物总DNA提取和PCR扩增采用化学裂解法，称取 5 g根际土壤样品，按照化学裂解法的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取。为了防止土壤样品所含腐殖质杂质对PCR扩增反响的抑制作用，对土壤样品的基因组DNA粗提液进行了纯化。采用Takara公司凝胶试剂盒对5种土壤样品的基因组DNA粗提液进行了纯化。表1 不同处理的土壤肥力比照Table 1 Soilfertility of different treatments 工程test items 对照 co

7、ntrol 树龄 tree age (years) 3 8 15 24 速效氮available nitrogen (mg/kg) 71 58 56 69 52 速效磷available phosphorus (mg/kg) 52 60 51 65 62 速效钾available potassium (mg/kg) 85 78 92 88 55 有机质 organic matter (%) 1.3 1.3 2.6 2.0 1.5 盐分 salt (%) 0.07 0.05 0.08 0.02 0.05 pH值 6.40 5.20 5.78 6.25 7.18 试验用引物设计参照文献，引物序列见

8、表2。真菌与细菌PCR条件反响体系(50 L)：10 xPCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，上下游引物各0.4 mol/L，模板DNA 2 L，Taq DNA聚合酶2.5 U农业论文，补充ddH2O至终体积50 L。真菌普通PCR反响程序：94预变性5 min，94变性1 min，52退火1 min，72延伸l min，35个循环；最后72延伸10 min。降落PCR(TD-PCR)反响程序为94预变性5 min，先10个循环(94变性30 s，退火温度从69到60，每个循环降低1，退火30 s，72延伸l min)，再于恒定退火温度59下进行18个

9、循环(94变性30 s，59退火30 s，72延伸l min)，最后72延伸10 min。细菌降落PCR反响程序为94预变性5 min农业论文，先20个循环(94变性l min，退火温度从65到55，每个循环降低0.5，退火l min，72延伸3 min)，再于恒定退火温度55下进行10个循环(94变性l min，55退火l min，72延伸3 min)，最后72延伸10 min。表2本研究中使用的引物Table 2 Primer used in this research 引物 Primers 序列 Sequence 靶 Target 参考文献 References ITS1 5-TCCGT

10、AGGTGAACCTGCGG-3 ITS region ITS2 5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 ITS region ITS1(GC) 5-CGCCCGCCGCGCCCGCGCCAGCCGCCGCGCCCGCCGCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ITS region F338(GC) 5-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 Bacteria specific R518 5，-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3 Bacteria specific Note: F, for

11、ward primer; R, reverse primer;Positions according to Escherichia coli 16S rDNA sequenceGC:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG1.5 调查工程：1.6 数据统计与分析试验结果用DPS (Date Processing System)软件7.05版进行统计分析，采用邓肯新复极差法测验DuncansANOVA，在p=0.05和p=0.01水平上进行差异显著性分析。DGGE图谱中DNA 条带由凝胶成像系统分析软件Imaging and Analysis Softwa

12、re ( Windows / Macin tosh，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)识别和统计。2 结果与分析2.1不同树龄苹果园土壤对再植平顶海棠幼苗株高和生物量的影响在来源于不同树龄的苹果园土壤中种植平顶海棠幼苗，30 d后即可表现出明显的再植病害病症。地上部表现为生长衰弱、枝条生长量小、树冠小、叶片深绿、顶端生长受阻。对株高的测量结果说明，果园土壤能够显著抑制再植海棠幼苗的生长农业论文，且不同树龄苹果园土壤对海棠幼苗生长的抑制也存在显著差异图1。随着苹果树龄的增加，对再植海棠幼苗生长的抑制作用越明显。苹果树龄为3、8、15和24年的果园土壤上种植

13、的海棠幼苗在移植3个月后较对照麦田土壤幼苗平均株高分别减少了31.22%、46.38%、57.66%和63.10%，差异到达极显著水平。图1 不同树龄苹果园土对平顶海棠幼苗株高比拟Fig. 1 The comparison of trunk height of Malusrobust Rehd. seedling of different tree age不同树龄苹果园土壤对平顶海棠幼苗的鲜重、干重均有显著影响。在树龄为3、8、15和24年苹果园土壤中再植的平顶海棠幼苗比在对照正茬土壤中的平顶海棠幼苗株高显著降低，生物量显著下降。在移植后90 d测量时发现，再植平顶海棠幼苗地上部干重分别减少0

14、.96%、57.58%、76.88%和78.10%；地下部干重分别减少40.38%、48.79%、64.03%和79.43%表3论文开题报告范例。结果说明，前茬苹果树龄对于再植海棠幼苗的株高、长势和生物量均有显著抑制作用，且前茬树龄越长，对后茬幼苗生长的抑制作用越强。表3 不同树龄苹果园土对再植平顶海棠幼苗生物量的影响Table 3 Effect of different previoustree age of orchard soil on replanted Malus robust seedling biomass 前茬树龄 Tree age of previous orchard 地上

15、部鲜重/g Shoot fresh Weight (g) 地上部干重/g Shoot dry weight 抑制率% Inhibitory efficacy% 地下部鲜重/g Root fresh weight 地下部干重/g Root dry weight (g) 抑制率% Inhibitory efficacy% 正茬对照Control 3.03 a 1.01 a - 2.88 a 1.20 a - 3年Three years 2.71 ab 1.00 a 0.96 2.10 ab 0.72 b 40.38 8年Eight years 1.29 bc 0.43 b 57.58 1.58 b

16、 0.62 bc 48.79 15年Fifteen years 0.67 c 0.23 b 76.88 1.25 b 0.43 c 64.03 24年Twenty-four years 0.62 c 0.22 b 78.10 1.06 c 0.25 d 79.43 2.2 不同树龄苹果园土的发病率与别离病原真菌的数量对海棠幼苗死亡率和病原真菌数量的调查结果说明，不同树龄苹果园土处理的平顶海棠幼苗的发病率、病原真菌数量均大于对照土处理。不同树龄苹果再植病害的发生情况存在差异，随着树龄的增长，海棠幼苗死亡率和病原真菌数量呈现递增的趋势。其中，再植海棠幼苗在前茬为24年生苹果树的土壤中校正发病率到达

17、了72.73%，而在前茬为3年生苹果树的土壤中校正发病率只有18.18%。值得指出的是，正茬对照根部也发现了少数病斑农业论文，发病率为8.33%，且在根段中别离到29个真菌菌落。24年生土壤中栽培的海棠根段别离到最多的真菌数量，到达了97个别离物。根据这一结果，随着苹果树龄的增加，土壤中真菌种类和数量也相应增加，再植时病害也相应加重。表4 不同树龄苹果园土的发病率与别离病原真菌的数量Table 4 Disease incidence and number of pathogenic fungi on the orchard soil of different tree ages 前茬树龄 Tr

18、ee age of previous orchard 发病率 Disease incidence/% 校正发病率 Corrected disease incidence/% 真菌别离物数量 Fungi isolates number 正茬对照Control 8.33 0.00 29 3年Three years 25.00 18.18 53 8年Eight years 33.33 27.27 69 15年Fifteen years 58.33 54.54 95 24年Twenty-four years 75.00 72.73 97 2.3 不同树龄苹果园土壤DNA的PCR-DGGE图谱分析DGG

19、E图谱中条带的数量根本表达了土样中真菌和细菌种群的数量，通过DGGE带谱聚类分析(clusteringanalysis)软件分析了真菌和细菌数量的多寡。对不同树龄苹果园土壤根际土壤真菌和细菌种群的DGGE比拟见图2。由图中可看出，每个样品各别离出了假设干电泳条带，且各条带所代表的PCR产物的产量和迁移率不同，进而表现出不同土壤样品中不同优势菌群的分布。 图 2不同树龄苹果园土壤根际真菌和细菌的DGGE图谱a 真菌的DGGE图谱b 细菌的DGGE图谱ck: 空白对照; 3, 8, 15, 24分别为3, 8, 15, 24的苹果树龄从图2可以看出，随着苹果树龄的增加，土壤中真菌种群呈现数量明显增

20、多，且条带亮度也明显增强的趋势，这说明随着苹果种植年限的延长农业论文，根围土壤中真菌种类和数量大量增加。而细菌种类和数量的变化趋势恰好相反，随着苹果种植年限的延长，根围土壤中细菌种类和数量呈现明显下降的趋势。说明随着苹果种植年限增加，土壤中真菌的种群数量相应增多，而细菌种群数量那么大为减少论文开题报告范例。3 讨论苹果重茬栽培时幼树往往根系发育不良，长势衰弱。本研究的结果证实了这一点。我国在20世纪90年代初是苹果种植面积快速开展的阶段，目前苹果主产区多数果园已经进入了盛果末期，更新换代迫在眉睫，连作障碍已成为生产上的重要问题。本研究发现，再植苹果砧木幼苗的生长量与前茬苹果的种植年限呈负相关，

21、而且随着前茬种植年限的延长，后茬苹果砧木幼苗根部发病率显著上升，病菌别离频率大幅增加。利用PCR-DGGE对土壤中微生物种群动态的研究说明农业论文，随着苹果树龄增加，根围土壤中微生物种群结构发生了显著变化，真菌种类和数量均显著增加，细菌种类和数量显著减少。一般认为，细菌数量较多是土壤肥力较高的一种表现，对苹果根系造成危害的主要是一些致病的真菌。Mazzola的研究说明，当苹果种植3年以上时，土壤中病原真菌的数量即增加到足以引起再植病害发生的水平。而土壤中Bacillus spp.和Pseudomonas spp.等细菌类群对土壤致病真菌有抑制作用。随着苹果种植年限增加，根际土壤中细菌数量下降，

22、真菌数量上升，土壤微生物群落从适于苹果生长的系统，转化为利于再植病害发生的系统。本研究发现，正茬土壤种植海棠幼苗有一定发病几率，从病根中也别离到一些病原真菌菌落。这说明一些土壤习居菌对苹果根系具有致病作用农业论文，且这些真菌可能受到苹果根系分泌物质的诱导，随着苹果种植年限的延长，病原真菌种群数量增加。研究再植土壤微生物种群的动态变化对于明确苹果再植病害与根际土壤微生物的相关关系有重要意义。据赵国栋等报道，土壤微生物主要集中在040 cm土层论文开题报告范例。因此，本研究采集了距离苹果树干1.5 m，深度10-30 cm的根际土壤作为供试土壤。本研究结果也说明，在这一范围采集的土壤用于研究苹果再

23、植障碍问题具有较好的代表性。PCR-DGGE法近年来越来越多的被应用于土壤微生物种群动态研究中。在DGGE图谱中，处于不同位置的每条DNA条带及其相对浓度(亮度)很可能代表微生物群落中某一特定微生物种及其在群落中的相对丰度。在PCR-DGGE方法中，由于PCR模板为土壤总DNA，其中既含可培养微生物的DNA，也含不可培养微生物的DNA，反映的微生物种类要比可培养微生物种类多。本研究结果也说明了利用PCR-DGGE法研究再植土壤微生物种群能够获得较为全面的种群动态变化数据，对于了解土壤微生物群落尤其是难培养微生物群落的变化具有重要的意义。苹果再植病害的发生是多种因素综合作用的结果，本研究明确了土

24、壤微生物种群的变化与苹果再植病害的发生有重要的相关关系。但是，不同种群微生物之间都存在哪些相互作用，以及苹果根系分泌物对于根际微生物的影响是怎样发生的？这些问题都还需要进一步研究。而明确土壤生态系统中植物根系与微生物种群之间的相互作用关系，对于解决苹果再植病害将具有重要的作用。参考文献【1】国家统计局农村社会经济调查司中国农村统计年鉴北京：中国统计出版社.2021, 159-161.【2】刘小勇,马彦,于良祖，等重茬苹果园土壤处理试验中国果树，2005,2: 16-18.【3】Ukhede R S, LiT CThe role of fungi, bacteria, and theirinte

25、ractions in replant disease complex in soils of British Columbia Acta Horticuturae, 1988, 233: 75-77.【4】Manici L M,Ciavatta C, Kelderer M, et alReplantproblems in South Tyrol: role of fungal pathogens and microbial population inconventional and organic apple orchards . Plant and Soil, 2003, 256:315-

26、324.【5】Jaffee B A,Abawi G S, Maiw F. Fungi associated with roots of apple seedlings grown in soilfrom an apple replant disease . Plant Disease, 1982, 66(10): 942-944.【6】Schoor L,Denman S, Cook N C. Characterisation of apple replant disease under SouthAfrican conditions and potential biological manag

27、ement strategies. ScientiaHorticulturae，2021，119：153-162.【7】Ferris M J,Muyzer G, Ward D M. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of16SrRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial mat community.Appl. Environ. Microbiol. , 1996, 62: 340346.Baudoin E, Benizri E, Guckert A. Impa

28、ct of artificialroot exudates on the bacterial community structure in bulk soil and maizerhizosphere . Soil Biol. Biochem. , 2003, 35: 11831192.罗海峰，齐鸿雁，薛凯，等PCR-DGGE 技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用 .生态学报，2003, 23(8): 1570-1575.White T J, Bruns T., Lee S, Taylor J W.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes forphylogenetics