分子发光分析法

1、第三章 分子发光分析法第一节 荧光分析法第二节 磷光分析法第三节 化学发光分析法第一节荧光分析法（Fluorescence）一 概述(一)、分子发射光谱与分子能级结构吸光无辐射跃迁系间跨越单重线态三重线态荧光磷光E0E1E2振动弛豫内部转换(二)、分子吸收光谱与分子荧光光谱吸光荧光250300350400450蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱相对强度300 400 500相对强度荧光光谱与吸收光谱镜像对称荧光光谱较吸收光谱简单硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光光谱与吸收光谱(三)、荧光量子产率（荧光效率）发荧光的两个必要条件 分子能吸收光子而跃迁至激发态 激发态分子能以光的形式释放能量荧光效率（f）=发出光子数

2、吸收光子数如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。化合物 荧光效率溶剂荧光素0.92（）曙红0.19（ ）罗丹明B0.97（乙醇）蒽0.31（己烷）核黄素0.26（水，pH7）菲0.10（乙醇）萘0.12（乙醇）酚0.22（水）叶绿素0.32（苯）某些化合物的荧光效率(四)、量子产率与分子结构荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的-电子共轭体系分子中，任何有利于提高-电子共轭度的结构改变，都将提高荧光量子产率，或使荧光波长向长波长方向移动。化合物荧光效率平均波长苯0.07283联苯0.18316对联三苯0.93342化合物荧光效率平均波长苯0.07283萘0.23334蒽0.

3、36402苯0.07283甲苯0.17285乙苯0.18286(五)、荧光分析的特点1、灵敏度高2、选择性好3、仪器简单4、应用范围广二荧光定量分析基础If = fIa= f ( Io-I )If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率(一)、荧光强度与浓度将指数展开：如果吸光度A 紫外-可见吸收光谱光源激光诱导荧光Laser Induced fluorescence低压汞灯：254 nm2、单色器滤光片棱镜光栅400 500600nmRelative FL IntensityEXEMWavelength /Stocks位移标准1样品2Wavelength /If荧光光谱I

4、f1 1A1 If2 2A2=量子产率的测定1A1 If1 2A2 If2=奎宁在的硫酸中荧光量子产率的绝对值为。荧光分析的缺点散射光影响磷光分析的仪器光源检测器贝克勒耳圆盘低温磷光分析固体基质室温磷光分析保护流体室温磷光分析无保护流体室温磷光分析磷光分析的缺点仪器复杂，需要固体基质或保护化学发光分析的仪器记录器四荧光、磷光和化学发光分析法（Fluorescence，phosphorescence and chemiluminescence analysis）(一)、理论基础1、分子发射光谱与分子能级结构吸光无辐射跃迁系间跨越单重线态三重线态荧光磷光E0E1E2振动弛豫（1）分子吸收光谱与分子

5、荧光光谱吸光荧光250300350400450蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱相对强度300 400 500相对强度荧光光谱与吸收光谱镜像对称荧光光谱较吸收光谱简单硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光光谱与吸收光谱（2）荧光量子产率（荧光效率）发荧光的两个必要条件 分子能吸收光子而跃迁至激发态 激发态分子能以光的形式释放能量荧光效率（f）=发出光子数吸收光子数如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%。化合物 荧光效率溶剂荧光素0.92（）曙红0.19（ ）罗丹明B0.97（乙醇）蒽0.31（己烷）核黄素0.26（水，pH7）菲0.10（乙醇）萘0.12（乙醇）酚0.22（水）叶绿素0.32（苯）某

6、些化合物的荧光效率（3）量子产率与分子结构荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的-电子共轭体系分子中，任何有利于提高-电子共轭度的结构改变，都将提高荧光量子产率，或使荧光波长向长波长方向移动。化合物荧光效率平均波长苯0.07283联苯0.18316对联三苯0.93342化合物荧光效率平均波长苯0.07283萘0.23334蒽0.36402苯0.07283甲苯0.17285乙苯0.182862、荧光定量分析基础If = fIa= f ( Io-I )If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率（1）荧光强度与浓度将指数展开：如果吸光度A 紫外-可见吸收光谱光源强度激光诱导荧光

7、Laser Induced fluorescence低压汞灯：254 nm2、单色器滤光片棱镜光栅400 500600nmRelative FL IntensityEXEMWavelength /Stocks位移标准1样品2Wavelength /If荧光光谱If1 1A1 If2 2A2=量子产率的测定1A1 If1 2A2 If2=奎宁在的硫酸中荧光量子产率的绝对值为。荧光分析的缺点散射光影响（3）荧光分析的特点灵敏度高选择性好仪器简单应用范围广第二节 磷光分析法低温磷光分析固体基质室温磷光分析保护流体室温磷光分析无保护流体室温磷光分析一 低温磷光分析法低温磷光分析是将试样溶于有机溶剂中，

8、在液氮（温度77K）条件下形成刚性玻璃状物后，测量磷光.这样，可减小分子间的碰撞，防止磷光猝灭.所用的溶剂应具备下列条件：易于制备和提纯；能很好的溶解被分析物质；在77K温度下应有足够的粘度并能形成明净的刚性玻璃体；在所研究的光谱区背景要低，没有明显的光吸收和光发射现象.表列出了部分低温磷光分析常用试剂.低温磷光分析常用试剂溶剂及组成混合比例（V/V）使用温度乙醇异戊醇乙醚（EPA）25577K异丙醇异戊醇乙醚25+577K乙醇甲醇碘乙（丙）烷164177K水乙二醇12123K150KEPA氯仿12177KEPA+碘甲烷（IEPA）10+177K三乙醇胺纯溶剂193K213K 二 室温磷光分析

9、低温磷光需要适当的低温条件，限制了它的应用及发展.室温磷光分析避免了低温条件，将试样固定在滤纸、硅胶、氧化铝、玻璃纤维、淀粉、溴化钾等基体上，以增加其刚性，减少三重态的碰撞猝灭，增强磷光相对强度.磷光分析的仪器光源检测器贝克勒耳圆盘第三节 化学发光分析法化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射称为化学发光，根据化学发光强度或化学反应产生的总发光强度来确定物质含量的方法称为化学发光分析法。一 化学发光分析的基本理论 (一)化学发光反应的基本要求：(1).化学反应必须提供足够的化学能，且被发光物质吸收形成电子激发态.如果在760nm280nm的可见紫外光区产

10、生化学发光，则要求化学反应提供160之间的能量，具有过氧化物中间产物的氧化还原反应一般能满足这种要求.因此，化学发光反应大多数是有H2O2、O3等参加的高能氧化还原反应.（2）.吸收化学能处于电子激发态的分子返回到基态时，能以光的形式释放出能量，或把能量转移到一个合适的接受体上，该接受体能以光的形式释放能量，产生敏化化学发光(sensitzed chemiluminescence).化学发光效率CL化学发光效率等于激发态分子的产率Ce和激发态分子的发光效率em之乘积. 化学发光的强度与反应物浓度间的关系 根据化学发光发生和消失时间的长短，通常分为快发光和慢发光两种.快发光在反应进行1秒之内即可达到发光峰值，在5秒之内峰值衰减90，慢发光的发生和衰减时间相对要长一些.不论是快发光还是慢发光，化学发光的相对强度ICL决定于化学发光反应的转化速率，而后者常用单位时间内反应物或产物浓度的变化表示. 灵敏度和检出限 化学发光分析法的灵敏度通常不是由仪器可检测的最低浓度决定的，因为许多化学发光法都是高灵敏的，仪器检测光的能量不是主要问题，而环境污染和其它低浓度的干扰因素及排除显得特别重要，它们往往决定方法的灵敏度.一般把所产生的化学发光相对强度等于空白信号标准偏差S0三