高效课堂同步课件：5-2多聚酶链式反应扩增DNA片段（选修1）

1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课程标准尝试PCR技术的基本操作和应用。课标解读1.理解PCR技术的基本原理。2.知道PCR技术的基本操作过程。3.讨论PCR技术的应用。 1生物体内DNA分子复制的条件(1)四种 是合成子链的原料。(2) 提供了DNA复制的模板。(3) 打开了DNA双链。(4) 催化合成DNA子链。(5) 使DNA聚合酶能够从 开始连接脱氧核苷酸。PCR技术的原理及反应过程 脱氧核苷酸DNA母链解旋酶DNA聚合酶引物引物的3端2PCR扩增的原理及条件(1)概念PCR即 ，是一种 迅速 的技术。它能以极少量的 为模板，在短时间内复制出上百万份的 。(2)原理DNA的热变性：在

2、 的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为 。当温度缓慢 后，两条彼此分离的DNA链又会重新 。子链的合成：a.需要 ；b.合成方向总是从子链的 端向 端延伸。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNADNA拷贝80100变性降低结合成双链引物53(3)条件 模板。分别与模板DNA两条模板链相结合的两种 。A、T、G、C四种 。耐热DNA聚合酶，一般用 。需要一定的 和能严格控制 的温控设备。DNA引物脱氧核苷酸耐高温的TaqDNA聚合酶缓冲溶液温度3PCR反应过程PCR一般要经历 次循环，每次循环可以分为 、 和 三步。(1) ：当温度上升到 以上时，双链DNA解聚为单链。(2

3、) ：温度下降到 左右， 通过 与两条单链DNA结合。(3) ：温度上升到 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。三十多变性复性延伸变性90复性50两种引物碱基互补配对延伸72DNA聚合酶思维激活1 DNA复制缘何必须有引物？提示DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3延伸DNA链，故DNA合成时，必须加入引物(其3游离)以作为延长DNA子链的“引子”。1细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的比较(见下表)项目DNA复制PCR扩增不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐热的TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录、

4、产生引物无转录、需加入两种引物特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次缓冲液不需要需要人为控制设备无需要严格控制温度变化的温控设备相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA为模板引物都需要与模板相结合的引物2.PCR过程(1)变性当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链。(2)复性温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸温度上升到72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。特别提醒(1)72 左右时，TaqDNA聚合酶有最大活

5、性，可使DNA新链由5端向3端延伸。(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。【巩固1】 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()。A94 、55 、72 B72 、55 、94 C55 、94 、72 D80 、55 、72 解析当温度上升到90 (9096 )以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 (4060 )左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 (7075 )时，溶液中的四种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合

6、成新的DNA链，称为延伸。答案A1实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控 ，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个 代替，操作时按程序在3个 中 PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为 ，实际上是进行 的场所。(3)微量移液器：用于 。PCR技术的实验操作及评价 温度恒温水浴锅水浴锅来回转移0.5mL多聚酶链式反应转移PCR配方中的液体2操作步骤准备 混合 反应。3操作提示(1)为避免 等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行 。(2)所用的 和 应分装成小份，并在 储存。(3)在 中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须 。加入组分设置PCR的循环

7、程序外源DNA高压灭菌缓冲液酶20微量离心管更换思维激活2 PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋转酶吗？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不是DNA解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在80100 温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。1PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸第1次94 ，10 min30次94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一次94 ，1 min55 ，30 s72 ，1 min (将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目的是使反应液集中在离心管底部) 3实验中D

8、NA含量的测定DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：稀释：2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零测定：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值计算：DNA含量(g)50(260 nm的读数)稀释倍数特别提醒若没有PCR仪，可进行水浴扩增DNA设置3个恒温水浴锅，温度分别为94 、55 和72 ，在3个水浴锅中依据PCR仪的处理时间来回转移PCR反应的微量离心管即可。【巩固

9、2】 聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述不正确的是()。APCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术B反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板CPCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变解析PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。答案C【例1】 (2011江苏)请回答有关问题。(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类

10、似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。PCR技术的原理 从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。第1组：_；第2组：_。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_。思维导图：归纳提升PCR技术特点：(1)PCR不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；(2)PCR需要耐热的DNA聚合酶，而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性；(3)PCR一般需经三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的控制。【例2】 使用PCR仪具体实验操作顺序应为()。设计好PCR仪的循环程