猪繁殖与呼吸综合征乳胶凝集试验（LAT）VIP

1、猪繁殖与呼吸综合征乳胶凝集试验（LAT）诊断试剂盒使用说明书猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是近年来发现一种新的病毒病。该病引起妊娠母猪发热、厌食和流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍；引起仔猪发热、呼吸困难、腹泻、消瘦及高死亡率；病猪在耳、腹侧和阴部皮肤出现蓝紫色斑块；少数猪出现神经症状。本病给养猪业带来较大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征乳胶凝集试验是将疫苗弱毒株致敏乳胶，研制成为抗原，检测猪血清中PRRS抗体达到诊断的目的，具有简便、特异、敏感的优点。1试剂盒的内容： 包括猪繁殖与呼吸综合征致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液、玻片、吸头及使用说明书。2用途： 用于猪繁殖与呼吸综合征血清

2、学诊断。3使用方法：1 定性试验： 取待检样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴，分置于玻片上，各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果。2 定量试验： 先将血清作边续稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。结果判定：1 对照试验： 出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“+”；阴性血清加抗原呈“”；抗原加稀释液呈“”。42 判定标准： “+”全部乳胶凝聚，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； “+” 大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+” 约50%乳胶凝集，但颗粒较细，

3、液体较混浊； “+” 有少许凝集，液体呈混浊； “” 液滴呈原有的均匀乳状。 以出现“+”以上凝集为阳性凝集。贮藏： 在2-8冷暗处保存，暂定1年。附注： 被检样品采集及处理方法。61血清：按常规方法采血及分离血清，要求无腐败无严重溶血。62使用前应轻轻摇匀乳胶抗原。（吴 斌）猪繁殖呼吸障碍综合症（PRRS）ELISA试剂盒（IDEXX公司）使用说明书试剂储存于2-7，只用于兽医 装量猪繁殖呼吸障碍综合症病毒抗原/正常宿主细胞抗原 5块 PRRSV/NHC包被板B 抗猪辣根过氧化物酶连结构用庆大霉素作为保护剂 60mlC 样品稀释液 150ml含蛋白稳定剂的磷酸盐缓冲液，用NaN3作为防腐剂D

4、 TMB（底物）稀释液 40ml 磷酸盐柠檬酸缓冲液，用庆大霉素作为保护剂E TMB浓缩液 40ml 用庆大霉素作为保护剂F PRRS阳性对照（血清） 4ml 溶解在磷酸盐缓冲液内的猪抗PRRSV抗体，含蛋白稳定剂以NaN3作为防腐剂G 洗涤液 200ml10倍含吐温磷酸盐缓冲液，用庆大霉素作为保护剂H 猪阴性血清对照 4ml与PRRSV不反应的猪血清终止剂 60ml含氢氟酸，用时小心样品的准备 用样品稀释液以1 ：40稀释待检样品（如10ul样品加390ul样品稀释液）注意：阴性对照阳性对照不用稀释。 每个样品吸取一定要换吸咀并记录每个样品在板上的位置。样品在加到ELISA板孔之前应混合均匀

5、。PRRSVNHCPRRSVNHCPRRSVNHCA阳性孔阳性孔553737B阳性孔阳性孔663838C阴性孔阴性孔773939D阴性孔阴性孔884040E11994141F2210104242G3311114343H4412124444 1 2 3 4 11 12注：P：加阳性对照；N：加阴性对照；1、2、3：加待检样品1、3、5、7、9、11列已用PRRSV包被；2、4、6、8、10、12列已用正常宿主细胞抗原包被。TMB底物溶液的配制 在应用之前，TMB溶液必须加到TMB稀释液内，（如每55mlTMB溶液加TMB稀释液55ml），TMB底物溶液应储存在室温并在稀释后1小时内使用。TMB稀

6、释液在使用时不要弄到金属表面。洗涤液的配制洗涤液（浓）应储存室温下并摇匀确保已沉淀的盐溶解；使用前洗涤液用蒸镏水或去离子水以1 ：10稀释，（如每30ul洗涤液加270ul蒸镏水或去离子水，可用于1块板）试验程序 在试验前所有试剂必须放在室温，且各种试剂应轻轻摇动或涡旋。 1拿出抗原包被板并记录样品在板上的位置。 2加100ul不稀释的阴性血清对照到酶标板上的C1、C2、D1、D2孔内（共4孔）。 3加100ul不稀释的阳性血清对照到酶标板上的A1、A2、B1、B2孔内（共4孔）。 4加100ul按1 ：40稀释的血清（待检）到酶标板的PRRSV和NHC孔内，每个样品只用2孔即PRRSV和NH

7、C各1孔。 5置室温作用30分钟。 6弃去孔内液体到废液缸内。 7每孔约用300ul的洗涤液（稀释后）洗涤3-5次。洗涤后弃去孔内液体。在板洗涤后加酶标抗体之前应避免酶标板干燥。在最后1次的洗涤弃去后，在吸水纸上轻轻拍酶标板。 8每孔加100ul酶标抗体（稀释后）。 9在室温作用30分钟，此时TMB底物溶液应配制好。 10重复步骤6和7。 11每孔加入TMB底物溶液100ul。 12室温作用15分钟。 13每孔加入终止液100ul以终止反应。 14在650nm处测量并记录样品与对照的吸光值（OD值）。 15计算结果。结果 为了确保试验成立以下条件必须满足： 与PRRSV反应的阳性对照平均OD值

8、减NHC与阳性对照反应的平均OD值之差必须大于或等于0150，通过计算样品与阳性对照的比率（S/P）来确定对PRRSV的抗体的有无。结果的解释 每一样品内PRRSV抗体的出现与否由样品与阳性对照的比率来确定。 1假如S/P是小于04，样品确定为PRRSV阴性。 2假如S/P是等于或大于04，样品确定为PRRSV阳性。计算 1阴性对照平均值（NC：PRRS）的计算：PRRSV抗原（孔C1、D1） C1（A650）+D1（A650） 011+013NC：PRRS= 如： =0122 2阳性对照平均值（PC：PRRS），PC（NHC）的计算PRRSV抗原（孔A1、B1） A1（A650）+B1（A650） 0360+0384PC：PRRS= 如： =0372 2NHC（孔A2、B2） A2（A650）+B2（A650） 006+007PC：NHC= 如： =00652样品（S）对阳性（P）的比率计算