中性pH条件下化能异养硝酸盐还原菌对亚铁离子的好氧与厌

1、中性pH条件下化能异养硝酸盐还原菌对亚铁离子的好氧与厌氧 氧化Arch Microbiol998, 169:159-165 IF= 1.975摘 要：百分之九十的厌氧富集培养都出自于一些淡水沉积物试样以及一些海洋沉积物，在 pH 7.2、30C条件下下，沉积物中的亚铁离子在硝酸盐和有机辅助物的矿物媒介中被氧化。 厌氧硝化的亚铁氧化是一个生物过程。从苦咸水沉积物中分离出的一种微生物(HidR2，运 动型不产芽孢的革兰氏阴性棒状菌)，进一步研究在醋酸盐环境中对亚铁离子的氧化作用。在微量醋酸盐(0.21.1 mM)环境中,pH 7.2、30C条件下，HidR2菌能厌氧和好氧氧化0.74.9 mM的亚

2、铁离子，其用于生长的能量来自于亚铁离子的厌氧硝化氧化，铁氧化比率是一个常 数，取决于醋酸盐的量的给予。中性条件下硝酸盐厌氧氧化亚铁离子的能力似乎是嗜温反硝 化细菌的共有特性。由于依赖硝酸盐的铁离子氧化关闭沉积物缺氧区的铁循环、铁离子的好 氧氧化促进含氧区内的二价铁再氧化为三价铁，这两个过程都增加了铁离子在自然沉积物的 有机质循环转化中作为过渡电子载体的重要性。关键词：铁氧化亚铁离子高铁离子硝酸还原作用沉积物1引言铁元素是地壳中含量最丰富的元素之一，也是含量第二丰富的金属元素。由于其低水 溶性，铁氧化物在水环境中通常以沉淀形式存在，如复杂的非晶形或晶体结构(Cornell and Schwert

3、mann 1996)。三价铁离子能够被异养菌还原为二价铁离子(Lovley 1991)，在有氧条件下，亚铁离子可 以在低pH值中被嗜酸细菌如氧化亚铁硫杆菌再次氧化(Blake et al. 1993)，或者在近中性环 境里，被铁锈色披毛菌氧化(Hallbecket al. 1993)，这两种细菌都是从氧化还原反应中获取能 量而生长。Fe3+/Fe2+的标准氧化还原电位为+770 mV，但是在自然环境中其实际的氧化还原电位很 大程度上取决于pH值的变化(Widdeletal. 1993)。在pH 7的碳酸氢盐环境下，FeOOH/FeCO3 的氧化还原过渡电位E值约为+200 mV。在较低的氧化还

4、原电位下，亚铁离子也能够充当给电子体，从而在厌氧环境中发生还原 反应，最近有研究者可以分离和描述能利用亚铁离子作为电子供体的不产氧光合细菌 (Widdel et al. 1993; Ehrenreich and Widdel 1994 +200 mV下的释放电子也可以用作微生物的 硝酸盐异化作用，最近报道了一种嗜温细菌(Straub et al, 1996)和一种极端嗜热的古细菌 (Hafenbradl et al, 1996)都具有这种新陈代谢功能。这一过程将铁循环和氮循环联系上，因此 也显示了微生物厌氧环境中铁离子作为电子受体的重要性。本文主要研究在兼性厌氧硝酸还 原菌辅助作用下亚铁离子的

5、氧化过程。2材料和方法2.1微生物的来源由于采取加富培养，各种沉积物试样被作为接种源，有淡水源(Vorsee,Mittlerer Buchensee,and Lake Constance,Germany)、海水源(Venice, Italy; Ameland and Groningen, Netherlands )、盐水源(Hiddensee,Germany)以及市政污水处理中使用的活性污泥源(Ko nstanz,Germany)。2.2培养介质和培养方法对于淡水和海水中细菌的加富培养，使用在缺氧条件下的碳酸氢盐缓冲溶液作矿质媒 介，且加入1mM的硫酸盐作为硫源，不需加还原剂，NaCl和MgC

6、l2的浓度则与微生物本身 的环境相适应，淡水中NaCl和MgCl2 6H2O的量分别为1.0 g和0.4 g，盐水中为7.0 g和1.0 g 海水中则为20.0 g和3.0 g。经高压灭菌，N2/CO2 (80:20, v/v)冷却后，每升溶液中分别加入1 ml 微量元素溶液 SL9(Tschech and Pfennig 1984)和7-维生素溶液(Widdel and Pfennig 1981)，并将pH调至7.2,。而对于需氧培养实验，培养基仍和上述方法一样，所不同的是缓 冲溶液由羟乙基哌嗪乙硫磺酸所替代。2.3富集与分离将50ml高压灭菌后的培养基装入120ml规格的血清瓶中，用丁基橡

7、皮塞密封好，在缺 氧条件下往里加入约5ml的接种体。并无菌地向基底分别注入浓度为4mM硫酸亚铁和5mM 硝酸盐。每个接种体均在pH为6.5、7.0、8.0，温度为16和30C下富集培养。培养周期为24 周，以棕色锈状沉淀形成为一个周期。苦咸水培养的细菌的纯化是用的琼脂稀释法(Pfennig and Truper 1981)： 60C下向25ml 的试管中加A3ml 3% (w/v)的琼脂溶液，再加入8 mM硫酸亚铁溶液，小心混匀，然后， 加入7ml 42C预热的含5 mM硝酸盐培养基，得到的亚铁离子最终浓度为4 mM。每根稀释后 的试管都经过密封、接种、水域冷凝以及N2/CO2 (80:20,

8、 v/v)气体吹扫，最后置于避光的30C 恒温箱中培养。在进入液体培养基前，微生物都是在琼脂上生长繁殖的。淡水和海水微生物的纯培养在平板基上分离。平板基的基质也是上述培养基加入).01M 丙磺酸作为缓冲溶液、1.5% (w/v)的琼脂、5mM硝酸盐和3 mM醋酸盐。在30C， N2/CO2(80:20, v/v)气氛下进行避光平板接种。培养好的菌种转移到呈有淡水培养基的血清瓶 (60ml )中。只有在瓶子中进行亚铁离子氧化的微生物才在琼脂板上显示多于两条条纹从 而得以纯化，并且将其转移到液体培养基中培养。在含有矿物质元素和0.2%的酵母膏的培养基中培养后的微生物在显微镜下进行纯化检 查。培养期

9、间需定期用显微镜检查微生物是否被污染。检测鞭毛是否形成，使用的方法是布 雷登-戈登堡银侵染法。2.4增长实验细菌在装有300m l培养基的瓶(500ml)中培养，未接种的空白试验瓶在相同条件下培 养至少两个月，但是始终未见到有能氧化二价铁离子的微生物产生。经过震荡后的样品放入 具塞瓶中，用N2/CO2 (80:20, v/v)气预吹，然后转移到盐酸或者磷酸缓冲溶液中准备下一步分 析。为保证在氧气梯度管中的生长实验，将4ml缺氧培养基装入22ml试管中，培养基中含 有1.5% (w/v)琼脂糖、15 mM亚铁离子、1 mM醋酸盐。在氮气保护下，等第一层凝结后， 再加入第二层培养基(0.5% (w

10、/v)琼脂糖)，将微生物接种在这一层上。等到第二层氮气保护 下凝固好以后再往上面加入1ml原培养基不含琼脂糖，为的是防止第二层琼脂糖的干结。试 管用铝盖轻轻盖上，垂直放入暗箱中在30C下，振荡培养(80rpm)。以上所有试验重复一 遍2.5分析方法亚铁离子的量用亚铁嗪分光光度法来测定(Stookey 1970)。总铁离子的浓度测定也是用 同样的方法即加入盐酸羟胺将所有的铁离子都还原成亚铁离子态(Stookey 1970)。三价铁离 子则有上述二者差值得到。为得到亚硝酸盐的含量，样品与一体积500mM的磷酸缓冲溶液 在厌氧环境下混合，并在室温下反应15分钟，然后在离心机上用最大转速离心5分钟。用

11、1ml 1M的盐酸将其又恢复粒子态。这样处理可以避免亚硝酸盐在分析前和分析过程中被亚铁离 子所氧化。如果试样中含有超过1mM的亚硝酸盐，则这个过程必须重复至少两次。由于铁 离子分析是在梯度管中进行的，所以琼脂糖要用刀片切成2mm后的薄片并加A1ml 5M的盐 酸。在40 C水浴中静置15分钟后，薄片已被酸化成液体，铁离子在上述过程中被测量完毕。 硝酸盐和亚硝酸盐用带有格鲁姆阴离子交换柱(Grom, Herrenberg, Germany)的高效液相色谱 来进行定量分析，在220nmT进行吸收检测。为了抑制铁离子和亚硝酸盐的相互反应，并且 为保护色谱柱，含铁样品中得加入磷酸缓冲溶液，上清液用于硝

12、酸盐亚硝酸盐的检测。这种 方法的对亚硝酸盐的检出限大约是30 pM。醋酸盐用气相色谱(GC6000 Vega Series 2; Carlo Erba, Milan, Italy)分析，使用填充柱 (2 mx2mm; 60/80 Carbopack C/0.3% carbowax 20 M/0.1% H3PO4)，火焰离子检测器。为了 保护柱子，醋酸盐试样也按上述方法准备。氧化二氮也用上述气相色谱分析，使用的填充柱 2 mx2 mm; 60/80 Carbosieve SII (Supelco, Bellefonte, Pa., USA)和检测器(热导池检测器) 不一样。根据Hall和Alle

13、r (1992)，铵盐用流动注射分析。蛋白质由以下分析：测定含铁样 品中蛋白质的含量，需要准备含有试样中相同铁量的蛋白质标样，为的是测定蛋白质化学分 析中与铁离子的可能反应。由于几种HidR2菌所对应的不同的光密度的蛋白质含量与干重呈 一种相关关系，根据这种关系，可以来计算蛋白质的干重。梯度管中的氧含量用三维显微操作器驱动氧微电极而测定。3结果3.1富集培养在710天的培养下，除了威尼斯海峡采集的沉积物以外，所有的富集培养都形成了棕色 锈状沉淀。通过化学分析，这些沉淀都被确定为铁的氢氧化物，而在未富集培养的培养基里 都未发现亚铁的氧化作用。经过三到四次转移培养，需加入醋酸盐或者琥珀酸盐作为有机

14、补 给物以维持亚铁离子的氧化作用环境。只有从格罗宁根市海洋沉淀物中富集培养的培养基不 用加入补给物而能不断氧化亚铁离子，即使重复转移一年以上也能进行反应。在比较所有富 集培养后发现，无论是在16C或30C还是?日为6.5或8,亚铁离子的转化率和潜伏程度都没有 明显的改变。3.2纯培养的特征从所有能发生亚铁离子氧化反应的富集培养中来看，纯培养独立的显示了亚铁离子厌 氧氧化过程中醋酸盐是作为有机补给物而硝酸盐则是作为电子受体。从波罗的海沉积物中分 离出来的HidR2菌种将被作为进一步研究的对象。图1 HidR2菌在醋酸盐和硝酸盐厌氧生长中的相差显微镜照片(图中横杠表示10微米)HidR2菌属于革兰

15、氏阴性，不产孢子的杆菌，大小为36X1呻(图1)，单极鞭毛运动 型，对氧化酶和过氧化氢酶产生极性。通过相差显微镜观察到细胞两端有微小深色包涵体， 用三氯甲烷处理后，这些包涵体消失，可能是由于聚羟基脂肪酸的富集产生。在过量醋酸盐 03 mM)中培养后，HidR2菌每一批能产生约1050个细胞。在含有亚铁离子、醋酸盐和 硝酸盐的液体培养基中，通过4,6-二脒基-2-苯吲哚盐酸染色法，可以发现绝大多数细胞都含 有絮状的三氧化铁或者肉眼可见的姜铁矿，但氢氧化铁并非包裹在细胞外部。在含醋酸盐和硝酸盐的琼脂培养基中，HidR2菌形成的则是白色松软的菌落。在在含亚铁离子、醋酸盐和 硝酸盐的琼脂培养基里，形成

16、的是深褐色的边缘不规则的球形菌落。此菌的温度适宜范围是 540C，最适温度是33C, pH范围在5.59.5之间，最适pH是7.5。在含硝酸盐、亚硝酸盐 或者氧化二氮的厌氧环境中或者在好氧环境中与氧反应的时候，HidR2菌始终是作为电子受 体。且在含有硫酸盐、延胡索酸盐或无定形氢氧化铁（作为电子受体）Lovley and Phillips 1986 以及醋酸或琥珀酸盐（作为给电子体）的培养基中，HidR2菌不能生长。经测试和氧化后的 给电子体有葡萄糖、果糖、木糖、树胶醛糖、丙酸盐、丁酸盐、L-乳酸盐、异丁酸盐、琥珀 酸盐、乙二醇、乙醇、甘氨酸和酵母膏；异戊酸、苯酸盐、甲醇和氨则不能被氧化。3.

17、3 HidR2菌对亚铁离子的厌氧氧化作用在没有有机补给物的厌氧环境中，HidR2菌不能生长也不能对亚铁离子的氧化进行有效 的测量，而加入醋酸或者琥珀酸以后效果就发生了明显的变化。304054 ED 7Q eoTim-e (h)251的1510 rEcnmc还芝CLW152035Time (days)Acgse. e(mW) 9 B 4 2如CE 5rl)ssOJd 言BpAosmCF32 5 4 s 2 1- D图2 a，b 在pH 6.7、30C，含有硝酸盐和醋酸盐的培养基中，HidR2菌对亚铁离子的厌氧硝化氧化作用， 亚硝酸盐未检测到（检出限为30aM）o a.不含亚铁离子；b.含有亚铁离

18、子。:蛋白质:硝酸盐。： 醋酸盐:亚铁离子:铁离子在pH 6.7、30C条件下，醋酸盐作为补给物，既记录了HidR2菌对亚铁离子的厌氧硝化 氧化作用，并且与不含亚铁离子的做了对比。在含有亚铁离子的培养基里，细胞以指数方式 生长，这种速度能持续45个小时。随着醋酸盐的消耗，大约14天左右细胞仍以两倍速度增长， 这取决于初始醋酸盐的浓度值。在没有亚铁离子的培养基里，细胞以指数形式增长只能维持 11个小时。从表1可以看出，HidR2菌在醋酸盐和亚铁离子作为底物的情况下，将硝酸盐转 化为了氮气和氧化二氮，这一点和其他种类的微生物作用一样。这一过程中并没有形成氨， 因为氨不能在厌氧环境中氧化。在高压灭菌

19、处理后，同样的试验方法没有得到亚铁离子氧化 和蛋白质量增加的结果。表1总结了厌氧条件下含和不含亚铁离子的情况，指出亚铁离子的氧化并不完全，添加 的亚铁离子只有近90%被氧化。通过加入1mM的醋酸盐或者5mM的亚硫酸铁，也不能改变 这一比例，这表明细胞无法利用剩余的亚铁离子。为证明醋酸盐对亚铁离子氧化程度的影响，设计了一系列不同醋酸盐浓度的生长实验 （图3）。约每增加1mM醋酸盐能够稳定地影响铁离子氧化的量，每消耗1mol的醋酸盐就会 反应4mol的亚铁离子。当超过供给铁离子的90%以后，即使再增加醋酸盐的量，铁离子也不 会再被氧化。3.4 HidR2菌对亚铁离子的好氧氧化作用图4给出了在含有梯

20、度氧浓度和亚铁离子以及少量醋酸盐的半固体培养基中，通过 HidR2菌新陈代谢对铁和氧的形成的影响。将未接种的试管中也进行了同样的试验，为的是 观察生物和化学氧化铁离子的不同。微生物在空气环境中培养4周，在培养后，在琼脂糖下 面形成了一片一片表面光滑且多层薄而紧密的多层含铁层。而在对照管内并没有形成上述一 样的层面，而是形成的橘色的铁离子层，比上述管内的层面要浅，但是更宽。化学分析表明： 相对于未接种HidR2菌的化学氧化而言，三价铁沉淀物的最大条带在琼脂培养基中位置要深 很多，其氧分压也要低很多，因此可以证实肉眼观察到的现象：二价铁可被HidR2菌有氧氧 化。显然，HidR2菌细胞能将大部分三

21、价铁固定到明显的一层，这一点在自然沉积物中也有 发现。表1 HidR2菌在含有醋酸盐和硝酸盐的培养基中，加铁和不加铁的厌氧生长情况下，其生长化学当量比和 底物转化情况。每一列代表着添加各种浓度的醋酸盐和亚硫酸铁的独立实验。低浓度醋酸盐对应着低的细 胞产率（第一、二列）不能给出可靠的蛋白质形成试验；相反地，在高浓度醋酸情况下的实验（第三、四 列）下，表中也没有关于干重的计算。所以用于细胞合成的电子也没有考虑在平衡计算中（第一、二列）（nd表示未检测到）。Presence of FeSO4 WithoutFeSO4Acetate supplied andconsumed (niM)0.21.13.

22、12.8FeSO+ supplied (mM)6.46.45.9Fe(ni) fonned (mM)0.74.943Nitrate consumed (mM)0.53.15.13.2Nitrite fcnned (niM)0000N2O formed (mM)0.060.771.60Cell dry mass formed (mg/1)ndnd5839Acetate assimilated (niM)andnd1.20.8Acetate oxidized CniM)b0.21.11.92丫乌(g diy mass niol acetate)ndnd3120Electrons recovered

23、 (%)c106108123100a醋酸盐的量是以C4H7O3形式的干重计算，根据方程：17acetate+11H+8C4H7O3+2HCO3-+4OH-b醋酸盐氧化的量是根据醋酸消耗量减去醋酸累计量c电子的回收率是用消耗硝酸盐氧化为氮气和部分氧化二氮减少的电子除以从醋酸盐氧化得到的电子（第 四列）或者是从加了铁盐的醋酸盐氧化中的电子（13列）得到的。由于第一、二列没有计算出醋酸的氧化， 所以可以得出醋酸是100%的消耗掉。Acetate supplied （mM）3E图3培养基中含有8mM亚硫酸铁和5mM硝酸盐以及各种浓度的醋酸盐条件下，HidR2菌对亚铁的氧化和醋酸的消耗情况。在pH=6.

24、8，30C下避光培养3周。3.5化学方法亚铁氧化作为对照试验化学方法氧化亚铁离子的条件和HidR2细菌的生长条件采用的是一样的，由于分子氧能很容易地氧化亚铁，例如不包含培养液的条件就可以检查分子氧通过穿透橡胶塞导致铁产生 化学性氧化。这种方法显示了在上述条件下培养6周也不会检测到亚铁离子的氧化。向pH为6.7含8mM亚铁离子的厌氧培养基中加入5mM的亚硝酸盐可以加快亚铁离子的 氧化速度。在4天内，亚铁离子的氧化速度为8如/h，而要消耗约0.8mM的亚硝酸盐。而当加 A1mM和0.3mM的亚硝酸盐时，在相同条件下均未检测到亚铁离子的氧化作用。0Fe(lll) (mM) 10203040 i i

25、i p ii02060tia 1DDOxygen % air saturation)Fe(lll) (m.M)IQ 203044Oxygen (% air saturatiion)图4 a, b在30C摇床上培养30天后，琼脂氧-二价铁梯度管中三价铁和氧的变化。a是HidR2菌的培养情况； b是对照实验。条状代表三价铁，圆点代表氧。4讨论在本文中，已经很详细的介绍了脱氮细菌在pH 7.2和30C下加入少量有机补给物而观察 在厌氧和好氧条件下对亚铁的氧化作用。鉴于在3日7.2下亚铁离子有很强的亲氧能力，控制 氧条件是很有必要的，主要是要区分生物氧化和非生物氧化亚铁离子。一定要注意避免氧从塞子进入

26、培养基中，并且亚硝酸盐也要在培养过程中随时检测，因 为在硝酸盐反应过程中亚硝酸盐可能富集，而它可以促进亚铁离子的化学氧化（Komatsu et al. 1977; Moraghan and Buresh 1977; Christianson and Cho 1983; Brons et al. 1991）。由于HidR2菌 在有机辅助物存在下能形成大量的三价铁离子，所以我们要排除由于硝酸盐还原产生的亚硝 酸盐和氧化二氮的化学氧化的干扰，对照试验可以得出以下结论：氧气穿透橡胶塞进入培养基中氧化亚铁这个假设不成立，因为在没有微生物中的对 照瓶中经过6周都没有检测到铁离子氧化作用。在HidR2菌的培

27、养基中，亚硝酸盐的促进作用也不成立，因为高于30MM （检出限） 的浓度下也没有被检测到;如果亚硝酸盐浓度在几个毫摩下才会对亚铁离子的化学氧化产生 影响，众所周知，这种情况只会发生在一些分批培养的脱氮剂中。氧化二氮的对亚铁氧化的影响同样可以被排除，因为浓度为50ml/l的氧化二氮（Straub et al. 1996），相当于2mmol/l，不会对铁产生氧化。由于所有化学氧化实验我们都按照生物实验条件来开展的，可以证明厌氧硝酸盐化的亚 铁离子氧化作用是一个生物催化反应。我们证明了 HidR2菌能够利用从亚铁离子氧化过程中得到的电子用于其异氧新陈代谢， 从而获取能量。这一结论是基于HidR2菌的

28、产率比较，在含有亚铁离子的培养基的产率要比 只含醋酸盐的产率高55% （表1）。HidR2菌的质量仍然是随着醋酸盐的减少而增加（图2）的 也能支持这一结论。很明显，醋酸盐在HidR 2菌的细胞合成过程是必不可少的，此微生物不 是自养型的。然而，醋酸盐并不是完全同化于细胞中，部分醋酸盐也反应在了多余的亚铁盐 中。当以足量醋酸盐给予反应时，其氧化反应和铁的是同时进行的，且以1:4的速率进行着 （图3）。显而易见的是，醋酸盐氧化所提供的电子用于醋酸吸收，这些电子不能在氧化铁时 被细胞所还原，可能是由于缺乏适合的反电子传递系统。含每摩尔醋酸的细胞产量(干重14g) 和每摩尔醋酸加了 4摩尔亚铁的细胞产

29、量(19g)比较可以看出，在细胞新陈代谢机制(1.75g/mole-)中，醋酸电子(EJ=290mV)要比亚铁氧化(1.0g/mol e-，E=200mV)产 生的电子效用高两倍以上。这一结论可以很好的解释所有的能量都由硝酸盐的电子转移而产 生2 NO3 公2的EJ=+751mV所有计算都是基于Thauer et al, (1977)。当在含有亚铁离子的厌氧环境中，发现HidR2菌生长缓慢，但这一现象并不一定是与铁 氧化代谢有关，可能是由于过量亚铁中毒的现象，或者是由于磷酸盐或其他微生物营养物的 低利用效率，也可能是这些营养物质与铁发生了沉淀反应(Hughes and Poole 1991)。关于铁厌氧氧化的生化作用仍然有几个公开的问题。要观察能量节省需要一个质子能够 穿过细胞膜而转移出来，我们并不知道亚铁离子是在细胞的那个部位氧化的，在亚硝酸盐和 氧化二氮存在的条件下，如果亚铁氧化定位在胞外质的话，问题就是形成的氢氧化铁是如何 转移到培养基中的。例如，亚铁离子还能够在细胞外面发生氧化反应。这就需要一个电子转 移系统穿过胞外质(如细胞色素)Stouthamer 1991; Ferguson 1994。