苹果砧木“中砧1号”茎尖离体保存研究

1、苹果砧木“中砧1号茎尖离体保存研究论文摘要：为了建立苹果砧木中砧1号;的茎尖离体保存技术，本实验以M9和富士为对照，研究了培养基中添加不同浓度蔗糖或生长抑制剂对试管苗生长速率的影响以及包埋枯燥法和玻璃化法预处理对试管苗茎尖超低温保存效果的影响。结果显示：不添加生长抑制剂，蔗糖浓度为20g-L 时，中砧1号试管苗离体保存效果比拟好。常规培养基中砧1号扩繁培养基为MS+BA0.5mg-L+IBA0.5mg-L；M9扩繁培养基为MS+BA0.6mg-L+IBA0.3mg-L；富士扩繁培养基为MS+BA1.0mg-L+NAA0.05mg-L；其中蔗糖30g-L，琼脂7g-L。培养温度为232，光照20

2、00lx，光照时间为14h-d。1.2试验方法蔗糖处理：将待保存培养苗接种在分别参加20、30ck、40、60、80g/l不同浓度蔗糖的MS培养基的试管中。CCC处理：将待保存培养苗接种在分别参加0ck、5、15、25、35mg/l不同浓度CCC的常规MS培养基的试管中。ABA处理：将待保存培养苗接种在分别参加0ck、0.1、0.4、0.7、1.0mg/l不同浓度ABA的常规MS培养基的试管中。B9处理：将待保存茎段培养苗接种在分别参加0ck、60、80、100、120mg/l不同浓度B9的常规MS培养基的试管中。将待保存培养苗分别接种在含有上述物质的MS培养基中，每个试管接种1株，5次重复，

3、接种后的试管用牛皮纸封口，放在光强2000lx，温度232，光照时间14h-d培养10天后，转到光照500lx、温度为42、全天光照下进行培养。4个月以后，用直尺测量植株高度，计算得出植株生长率生长率=最终植株高度-原初植株高度/原初植株高度，使用Excel和SPSS数据分析软件对实验数据进行分析。继代培养60d以上的材料置于4预培养驯化1个月，剥茎尖分别进行包埋枯燥法和玻璃化法预处理。包埋枯燥法：将茎尖置于MS+0.3mol-l蔗糖的固体培养基4预培养1d，用滴管吸取含一个茎尖的液体转移至100mmol-lCaCl及0.1、0.3、0.5mol-l蔗糖的培养液中分别包埋2、3、4、5h，无菌

4、空气枯燥，装2.0ml冷冻管，每管装10个茎尖，迅速投入液氮。每个处理20-30个茎尖，3次重复。玻璃化法：将茎尖置于MS+0.7mol-l蔗糖的固体培养基4预培养1d，装2.0ml冷冻管，每管装10个茎尖，在室温下用60%的玻璃化溶液PVS2装载30min，分别在PVS2、PVS3、PVS4、PVS5中0处理30、60、90、120min，移去原液，装入新鲜的保护液迅速投入液氮。每个处理20-30个茎尖，3次重复。材料经超低温保存至少24h后取出冷冻管，25水浴化冻2min，蔗糖浓度为1.2mol-l的MS培养液洗涤，将茎尖接种到恢复培养基MS+BA0.6mg-L+NAA0.1mg-L+GA

5、0.5mg-L中，暗培养一周，转移到光下培养，以形成叶或嫩芽为存活标准，统计再生率。2结果与分析2.1不同浓度蔗糖对试管苗生长速率的影响表1不同浓度蔗糖对试管苗生长速率的影响Table1Effectofdifferentconcentrationofsucroseongrowthrateofinvitroshoots 浓度 Concentration /g-L 生长率 Growth rate/% 中砧1号 (Zhongzhen1) M9 富士 (Fuji) 20 30 40 60 80 注：为茎尖或植株死亡。数据采用LSD方差分析方法，小写字母表示不同处理间的差异显著性(P)。下同。蔗糖浓度对

6、中砧1号试管苗生长速率有显著影响。与常规培养基30g-L相比，高浓度蔗糖80g-L和低浓度蔗糖20g-L均显著抑制中砧1号试管苗生长，20g-L和80g-L蔗糖中砧1号生长速率最低。M9和富士试管苗对蔗糖浓度的反响与中砧1号根本一致。20g-L和60g/L蔗糖浓度时M9生长速率最低，蔗糖浓度到达80g-L时植株茎尖出现死亡；蔗糖浓度为20g-L、60g-L和80g-L时富士试管苗生长均缓慢。中砧一号试管苗低温保存适宜的蔗糖浓度为20g-L。2.2不同浓度CCC对试管苗生长速率的影响表2不同浓度CCC对试管苗生长速率的影响Table2Effectofdifferentconcentrationo

7、fCCCongrowthrateofinvitroshoots 浓度 Concentration /mg-L 生长率 Growth rate/% 中砧1号 (Zhongzhen1) M9 富士 (Fuji) 0 5 15 25 35 CCC浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。培养基中参加低浓度CCC5mg-L就能显著抑制中砧一号试管苗生长。M9和富士试管苗对CCC的反响与中砧1号根本一致，即CCC浓度为5mg-L时，就可以对M9试管苗起到明显的抑制作用；浓度到达15mg/L时，对富士试管苗抑制作用明显，但高浓度产生毒害作用，茎尖死亡。中砧一号试管苗低温保存适宜的CCC浓度为5mg/L。2.

8、3不同浓度ABA对试管苗生长速率的影响表3不同浓度ABA对试管苗生长速率的影响Table3EffectofdifferentconcentrationofABAongrowthrateofinvitroshoots 浓度 Concentration /mg-L 生长率 Growth rate/% 中砧1号 (Zhongzhen1) M9 富士 (Fuji) 0 0.1 0.4 0.7 1.0 ABA浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。低浓度0.1mg-L对中砧1号有明显的抑制作用。M9与富士对ABA浓度的反响与中砧1号完全一致，浓度到达0.4mg-L时，富士植株茎尖死亡。2.4不同浓度B9

9、对试管苗生长速率的影响表4不同浓度B9对苹果品种和砧木试管苗生长率的影响Table4EffectofdifferentconcentrationofB9ongrowthrateofinvitroshoots 浓度 Concentration /mg-L 生长率 Growth rate/% 中砧1号 (Zhongzhen1) M9 富士 (Fuji) 0 60 80 100 120 B9浓度对中砧1号试管苗生长速率有显著影响。浓度为60mg-L时，中砧1号就能表现出明显的抑制作用。M9与富士对B9浓度的反响与中砧1号根本一致。浓度到达80mg-L时，中砧1号植株茎尖死亡，而M9和富士试管苗在B9

10、浓度为100mg-L时茎尖死亡，不适合保存。2.5包埋枯燥法预处理对离体茎尖再生率的影响表5包埋枯燥法对离体茎尖再生率的影响Table5Regenerationrateofshoottipsafterencapsulation-dehydration 预培养蔗糖浓度 Preculture sucrose concentration /mol-l 再生率 Regeneration rate/% 包埋时间 Encapsulat- ion time /h 中砧1号 (Zhongzhen1) /% M9 /% 富士 (Fuji) /% 0.1 2h 3h 4h 5h 0.3 2h 3h 4h 5h 0

11、.5 2h 3h 4h 5h 各个试验处理对中砧1号离体茎尖再生率有显著差异，预培养蔗糖浓度0.3mol-l，包埋枯燥时间为4h时，恢复生长率最高，为71.33%。在同一处理下，M9和富士恢复生长率也较高，分别为60.67%和54.67%。M9预培养蔗糖浓度为0.1mol-l，包埋枯燥时间为3h、4h、5h三个处理之间没有显著差异。预培养蔗糖浓度0.1mol-l，包埋时间5h时，富士茎尖恢复生长率最高。2.6玻璃化法对离体茎尖再生率的影响表6玻璃化法对离体茎尖再生率的影响Table6Regenerationrateofshoottipsaftervitrification 玻璃化液 Vitri

12、fication solution 再生率 Regeneration rate/% 处理时间 Treatment time/min 中砧1号 (Zhongzhen1) /% M9 /% 富士 (Fuji) /% PVS2 30 60 90 120 PVS3 30 60 90 120 PVS4 30 60 90 120 PVS5 30 60 90 120 各个试验处理对中砧1号离体茎尖再生率有显著差异。PVS2处理60min、PVS3处理90min均能获得较高的恢复生长率。M9和富士在PVS3处理90min时成活率较高，均为67.33%。与中砧1号不同的是两者在PVS4处理90min时，能获得最

13、高的恢复生长率。3讨论依据本研究结果，20mg-L是中砧1号试管苗离体保存培养基中的最正确蔗糖浓度。高浓度和低浓度蔗糖均可显著抑制试管苗生长。一般认为蔗糖浓度变高，培养基的渗透压增加超过了可承受的范围，养分水分吸收受阻，从而抑制生长。百合种质资源离体保存中，蔗糖浓度提高到50-90mg-L，有效抑制植株生长，试管苗可保存11个月以上。培养基中参加低浓度蔗糖，植物材料处于半饥饿状态，有效地获得减缓生长的效果，从而到达延长保存期的目的。低浓度蔗糖与高浓度蔗糖都具有抑制生长的良好效果，从节省本钱考虑，采用低浓度蔗糖为宜。培养基中添加的CCC浓度为5mg-L时中砧1号试管苗离体保存效果最正确。枇杷的种

14、质保存中，25mg-L的CCC较适宜，过高浓度的CCC对枇杷生长抑制作用明显，但会导致死亡率上升，不利于枇杷种质的保存；而在另一些植物种质保存中，CCC应用浓度那么比拟高，如CCC浓度为10-40mg-L时，对百合种质无抑制作用；而在葡萄种质离体保存中，CCC浓度为60-90mg-L是适宜的。培养基中添加的ABA浓度为0.1mg-L时中砧1号试管苗离体保存效果最正确。在猕猴桃种质保存试验中，ABA的应用浓度比拟低，适宜浓度为0.1-0.5mg-L，有效延长继代间隔时间，保存8个月，存活率在53%以上。而另一些植物上，ABA应用浓度那么比拟高，在百合种质资源离体保存中，ABA浓度为1.0-3.0

15、mg-L，对百合试管苗生长的抑制效果较好，以1.0mg-LABA最为适宜。3-10mg-L的ABA抑制枇杷植株的生长是适宜的。本研究认为B9的抑制作用比拟强烈，只有低浓度60mg-L时，可以保存中砧1号，但是80mg-L因为抑制过度而死亡。郭延平等在培养基中参加50mg-L的B9和0.1mg-L的ABA在室温下将称猴桃的试管苗保存了9个月。因此，不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差异，同一种抑制剂应用在不同的植物中，要到达抑制作用而不对植物造成伤害所需要的量也有所不同。Sakai等认为PVS2处理苹果、梨、苜蓿等效果最正确。在香蕉种质保存中发现PVS2的效果最好，PVS1次之，而PVS3和

16、PVS4的成活率几乎为零。本试验用PVS2、PVS3玻璃化法保存中砧1号离体茎尖，均得到较高存活率。但包埋枯燥法的存活率与玻璃化法没有明显差异，而包埋枯燥法茎尖没有恢复期，可以直接生长，并且一次可以处理大量茎尖，因此，包埋枯燥法更适用于中砧1号的超低温保存。参考文献1 CHENG Ming-hao, YANG Xiao-hong, ZENG Ji-guang. A preliminary report on investigation and study of Malus xiaojinensis an apple stock resource. Journal of Southwest Ag

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