缓冲液的配制培训资料

1、缓冲液的配制Elisa相关试剂的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液 0.01mol/L pH7.2PBSNaH2PO42H2O 0.39克；Na2HPO41.27克；NaCl0.85克；NaN3200 mg; H2O （蒸储水）至 1000ml2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4, PBSTNaCl 2.0 克；KH2PO40.2 克；Na2HPO4 12H2O2.9 克；KCl 0.2 克；NaN30.2 克；H2O 至 1000ml 吐温（Tween） 20 0.5ml;4C保存备用3、包被液（简称CB） pH9.6Na2CO31.59克；NaHCO32.93 克；NaN30.2

2、 克；H2O 至 1000ml密封盖好，4 存放备用4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.00.1mol/L 柠檬酸（21.014克/100ML） 24.3ml; 0.2mol/L Na2 HPO4 （28.4克/L）25.7ml; H2O 50ml;4 C存放备用5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6 tris-HCLTris 6.05 克；HCL（36%）3.15 克（约 2.7ml 浓 HCL） ; H2O 至 1000mlDAB为3 ,3二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色ELISA试剂配制及实验流程是酶联接免疫吸附剂测定（Enzy

3、me-Linked Immunosorbnent Assay ）勺简称。以双抗体夹心法举例说明。试剂配制:（1）包被缓冲液（PH9.6 +0.2 0.05M碳酸盐缓冲液）：Na2CO31.59g ;NaHCO3 2.93g ;加蒸储水至1000ml。（用时稀释成1x,力口0.1%BSA）（2）洗涤缓冲液（PH7.4 0.15M PBST）: 0.05%Tween-200.5ml;加在 PBS缓冲 液 1000ml 中。PBS缓冲液：KH2PO40.2g ; Na2PO412H2O2.9g ;NaCl 8g ; KCl 0.2g；加蒸储水至 1000ml。封闭缓冲液：牛血清白蛋白（BSA）2%2

4、g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。（4）稀释液：牛血清白蛋白0.1 % 0.1g ;加PBS缓冲液100ml。（5） 底物缓冲液（PH5.0） : 0.2M Na2HPO4（无水28.4g/L,带12结晶水71.7g/L）取 25.7ml 0.1M 柠檬酸（无水 19.2g/L,带 1 结晶水 21.01g/L）取 24.3ml;加蒸储水至100ml。（或Na2HP0412H2O1.84g；柠檬酸H2O 0.51g力口 蒸储水至100ml）（6）TMB（四甲基联苯胺）显色液（显蓝色）：TMB（2mg/ml水） 0.05ml;底物缓冲液0.95ml; 30% H2O2 0.001ml

5、 ;总体积 1ml。（7）或配OPD（邻苯二胺）显色液（显黄棕色）（现配避光）： OPD （干粉）一一0.004g；底物缓冲液 10ml ; 30% H2O2 0.015ml（总体积 10ml。（8）终止液（2M H2SO4）:在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M,约98%）21.7ml,边加边摇。操作步骤：.包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为110闺/ml。在每板的反应孔中加0.1ml, 4c过夜（或37c温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。（简称洗涤，下同）。.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置 37c温育2小时。然后 洗涤3

6、次.加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37c温育12小时。然后洗涤。（同 时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔 ）。.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体 0.1ml。置37c温育12小时。然后 洗涤。.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体 0.1ml。37c温育45分钟1 小时，洗涤5次。.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml （或OPD显色液），37c暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。.终止反应：各反应孔中加入 2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD 底物黄色变棕色）.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结

7、果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“ +”、-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照 OD值的2.1倍，即为阳性（以 空白对照孔调零后计算）。4间接法操作步骤:.包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定） 4c过夜（或37c温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。（简称洗涤，下同）。.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置 37c温育2小时。然后 洗涤。.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体 0.1

8、ml。置37c温育12小时。然后 洗涤。.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37c温育45分钟1小时，洗涤5次。.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml （或OPD显色液），37c暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。.终止反应：各反应孔中加入 2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD 底物黄色变棕色）.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“ +”、-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使

9、用492nm检测。通常大于规定的阴性对照 OD值的2.1倍，即为阳性（以 空白对照孔调零后计算）。孕酮1包被缓冲液，（1）碳酸盐缓冲液（PH9.6 +0.2 0.05M）Na2CO31.59g; NaHCO32.93g;力口蒸储水至1000ml0(2) tris缓冲液(0.05mol/L) 50ml 0.1mol/L (Tris)溶液与 x ml 0.1mol/L 盐酸 混匀后，加水稀释至100ml各种pH伯:的Tris缓冲液的配制所需pH值(25C)7. 17. 27. 37. 47. 57. 67. 77. 87. 98. 010.1mol/L HCl 的体积45. 744. 743. 4

10、42. 040. 338. 536. 634. 532. 029. 226.222.919.917.214.712.410.38.57.0某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml 0.1mol/L盐酸的配置：买来的浓盐酸是12 mol/L的，以配制1L 0.1mol/L的盐酸为例：先用量筒量取8.3 mL的浓盐酸倒入容量瓶，然后将溶液加蒸储水稀释至体积为1 L,此时的溶液就是0.1mol/L的盐酸。0.1mol/Ltris 的配置：0.1 mol

11、/L 溶液为 12.114 g/L则配制600mlTris缓冲液的方法：三羟甲基氨基甲烷：3.6g浓盐酸：2.09ml3） 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4） 磷酸二氢钾0.2g；磷酸氢二钠 2.90g；氯化钠8g；加去离子水定容到 1000ml 02 洗涤缓冲液（pH7.4 0.15mol/L）0.05%Tween-200.5ml;力口在 PBS 缓冲液 1000ml 中。PBS缓冲液：KH2PO4 0.2g； Na2HPO412H2O2.9g； NaCl 8.0g；KCl0.2g加蒸储水至1000ml 03测定缓冲液（Ph7.0含0.87% NaCl和0.1 % BSA的0.1M

12、磷酸缓冲液）用于标 准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。Na2HPO412H2O 21.85g； NaH2P04 2H2O6.08g； NaCl 8.70g； BSA1.00g溶于1000mL蒸储水中4封闭缓冲液牛血清白蛋白（BSA） 2% 2g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100 ml。0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.6）+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml5底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液0.2M Na2HPO4（无水 28.4g/L,带 12 结晶水 71.7g/L）取 25.7ml0.1M 柠檬酸（无水19.2g/

13、L,带1结晶水21.01g/L）取24.3ml加蒸储水至100ml。或 柠檬酸（C6H8O7 H2O 0.47g； Na2HPO4 12H2O2.00g；6 （1） TMB（四甲基联苯胺）显色液（蓝色）A液（3, 3 ,5, 5-四甲基联苯胺，TMB）:称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100mlB液（0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4）称取Na2HPO412H2O14.34g,柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，力口 0.75%过氧化氢尿素 1.28ml,定容至 200ml,调 pH 至 5.0-5.4。将A液和B液按

14、1: l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液或 TMB（2mg/ml水） 0.05ml:底物缓冲液 0.95ml; 30% H2O20.001ml;总体积1ml。OPD（邻苯二胺）显色液（黄棕色）（现配避光）OPD （干粉） 0.004g；底物缓冲液 10ml; 30%H2O20.015ml;总体积 10ml 0TMBS底物液（用于显色）10mg四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）的二甲基亚碉溶液，用底物缓冲液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。用前加 H2O2溶液30%左右。7终止液2mol/L H2SO4用于终止反应在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M,约98%）21.7ml,边加边摇

15、。（浓H2SO4:蒸储水=1:9）抗原修复液：根据待检测的抗原，选择适当的方法附：抗原修复液（10mM pH6.0枸檬酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A:枸檬酸三钠-2H2O 29.41g+1000mlB:枸檬酸21g+蒸储水1000ml工作液的配置：A液82ml+B液18ml+蒸储水900ml抗原修复方法：高压锅处理技术：枸檬酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片，盖上高压锅，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲，以助冷却)微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸檬酸钠缓冲液淹没切片，选择中或高档，5分钟；取出并补充已预热的枸檬酸钠缓冲液；再

16、选择中或高档，5分钟(最佳温度9295C)抗原修复注意事项：组织不能干，选择抗原修复方法要因抗体而异。该方法主要用于10%福尔马林固定，石蜡包埋组织。抗原修复后至 DAB显色的过程中，均要用PBS缓冲 液。DAB的配制：储备液(DAB 25mg/ml)的配置：DAB250mg+pbs10ml,待完全溶解后分装成1ml,100uL 50ul, 20ul,等一20C冻存。工作液：DAB 储存液 20ul+PBS1000ul+3%H2O2 5ul;0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.0,1000ml):柠檬酸三钠3g柠檬酸0.4g。0.5mol/L EDTA 缓冲液(ph8.0) : 7

17、00ml 水中溶解 186.1g EDTA&8226;2H2O,用 10mmol/L NaOH 调至 ph8.0,加水至 1000ml.1mol/L的TBS缓冲液(ph8.0):在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl 调至 pH8.0,加水 1000ml0酶消化液：a.0.1%tt蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用 0.1N的HCl配制3%甲酉IH2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0 95）等量混合b油和 TBS（PBS）配制TBS/PBS PH9.095,适用于

18、荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本二抗稀释剂：0.05%叠氮钠；0.01M磷酸缓冲液（PBS） pH7.2 （注：1升）注备：1）二抗稀释剂可以储存在4 OC , 6个月.2）不要用含有牛血清白蛋白或其它血清的稀释剂来稀释二抗，因为二抗可能会与牛血清白蛋白或其它血清反应.3）用TBS稀释二抗会降低染色，因此TBS用于有强背景的抗体活碱性磷酸酶标记得二抗，因为磷酸盐可以抑制碱性磷酸酶的活性.辣根过氧化酶-链霉亲和素（HRP-Streptavidin Dilution Buffer）稀释剂：0.01M磷酸缓冲液（PBS） pH7.2 （S: 1升）0.05%硫柳汞注备:此稀释剂可以

19、储存在4 oC , 6个月.碱性磷酸酶-链霉亲和素（AP-Streptavidin Dilution Buffer）稀释剂:0.05M Tris缓冲液（TBS）, pH 7.6 ;0.05% 硫柳汞注备：1）此稀释剂可以储存在4 oC , 6个月.2）磷酸缓冲液不能用来稀释碱性磷酸酶-链霉亲和素，因为磷酸盐回抑制碱性磷酸酶活性.荧光染料（Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA） 稀释剂：0.01M 磷酸缓 冲液（PBS） pH7.2 （注:1升）0.05%硫柳汞荧光封片剂荧光染色封片剂有几种：1.缓冲甘油封片介质（常用）0.5mol/L碳酸盐缓冲液

20、（pH8.5）, lOml;无荧光甘油（AR级），90ml,混合后在搅拌器上充分混匀。2.聚乙烯醇一缓冲甘油混合介质0.5mol/L碳酸盐缓冲液（pH8.5）, 40ml;1%聚乙烯醇，lOml;分析纯甘油，lOmlo三液混合后，不断搅拌6h, 72000g 离心1h,吸取上清4c保存备用。3.荧光信号增强封片剂聚乙烯醇40-88,4.8g；分析纯甘油，12ml;蒸储水，12ml; 0.2mol/L Tris盐酸缓冲液（pH8. 5）, 24ml; l, 4一重氮双环一2, 2, 2一辛烷，L 25g（终浓度约2. 5%）。另外有供应抗荧光衰减封片剂，以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬 灭剂，有

21、强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。样品封 片后4oC或-20oC避光保存2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光 发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。适用于所有光谱范围的荧光如 FITC,Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。|荧光封片剂配制：称取 NaHC03 3.7克，无水Na2c03 0.6克溶于100m1三蒸水中，然后与甘油 1:1混 合，4c保存。200微升的甘油和800微升的0.01M的PBS伊红（1）

22、伊红（水溶性）配方：伊红（水溶性）2.5-5 g蒸储水500 ml将水溶性伊红溶于蒸储水中，然后加浓盐酸10毫升，充分搅拌，静置过夜后过滤。过滤后的沉淀用蒸储水冲洗二次，再过滤；将沉淀物连同滤纸一起放入温 箱内干燥，力口 95%酒精1000毫升，配成饱和液。使用前再用 95%的酒精1:1 2倍稀释，加入12%冰醋酸。此方法具有染色时间快，颜色鲜艳，不容易褪色，使用寿命长等特点（2）伊红（醇溶性）配方：伊红（醇溶性）2.5-5g75%酒精1000 ml,加几滴冰醋酸至半透明状TAE缓冲液TAE是使用最广泛的缓冲系统。具特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质

23、量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约 10%,电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收 DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。50XTAE Buffer 配制方法：1。称量 Tris 242g, Na2EDTA.2H2O 37.2g 于 1L 烧杯中；2。向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；3。加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；4。用NaOH调pH至8.3,加去离子水定容至1L后，室温保存。使用时稀释50倍即1 XT

24、AE Buffer（5X） TBE缓冲液1L名称：TBE （Tris硼酸），是一种PCR技术中用到的缓冲液。445 mmol/L Tris 碱54g ;445 mmol/L 硼酸盐27.5g 硼酸；10 mmol/LEDTA 20 ml 的 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）;水补足 1LTRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成 PH值为6.8, 7.4, 8.0, 8.8。其PH值随温度变化很大。一般来说、温度每升高一度、PH值下降0.03。1M TRIS-HCl 6.8 和 1.5M TRIS-HCl 8.8 是 SDS最常用的试剂。而由TRIS配成的TAE , TBE等是DN

25、A电泳最常用的试剂，TE (PH8.0)主要用于溶解DNA。TE为Tris力口 EDTA合称。CAPS现在蛋白质的PVDF转膜已经不用Tris-gly、SDS、20%甲醇缓冲液：，因为缓冲液中有甘氨酸，所以测序的时候很难区分甘氨酸是BUFFER带进去还是蛋白质本身的。现在测序用的转膜缓冲液是：10mM/l CAPS,10%的甲醇。CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是 020%, 一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白质的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。配制CAPS电印迹缓冲液。方法如下：10 XCAPS (100mmol/L)CAPS 22.3g;力口去

26、离子水至900ml;用2mol/L NaOH (约20ml)将pH值调至11.0,然后定容至1L,贮存于4C。CAPS电印迹缓冲液(含10%甲醇的1XCAPS):10XCAPS 200ml;甲醇 200ml;去离子水 1600mlstripping1、stripping buffer含有适量的SDS,在低ph值或适当的温度下，可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。使用 stripping buffer可以去除一抗和二抗，然后 可以重新利用膜。2、完全可以用同一种抗体再杂交一次我的经验是同一张膜stipping3次就差不多了，而且用同一种一抗，信号强度是 一次比一次递减的。strip的配方有多种，不同的配方，strip的原理都不太相同。但是目的都只有一个，那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。（洗脱一抗二抗）St