WB操作步骤-自己整理

1、Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习 姚瑶（一）目的蛋白提取：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉细胞培养液， 加入 Hanks 液洗涤一次后倒掉， 根据 所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约 5ml ）新鲜细胞培养液 后，将贴壁细胞吹起，并转移至 4 支离心管内，配平后， 1500 转离 心 10min 。2、倒掉上清，用 4 度预冷 PBS溶液洗涤沉淀， 1500 转离 心 10min 。共洗三次，每次十分钟。3、倒掉上清，吸净，每管加入 50ul 细胞裂解液 RIPA，吹 散，加入后由于 DNA 的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至 1.5ml

2、EP 管内， -20裂解 30min。4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解 15s。（可不做）5、4， 12000 转离心 10min。6、将上清转移至 0.5ml EP 管中，每管 100ul，冰浴待用。（2）组织中总蛋白的提取：1、取约 100mg 肝组织于研磨器内，加入 500ul 细胞裂解 液 RIPA，研磨后吸出于 1.5ml EP管内，再加入 500ul RIPA，研磨后 吸出于上 EP 管内。冰上裂解 30min。2、配平后， 4， 14000 转离心 10min。3、将上清分装于 0.5ml EP 管内，每管 100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：1、稀释标准品： 10ul 标

3、准品 C 液+90ul PBS 溶液，混匀。2、按 0、1、 2、4、8、 12、16、 20ul 将稀释后的标准品加入 于 96 孔板内，并用 PBS 将各孔补足 20ul 。3、将第 2、3 排 96 孔板分别加入样品 1ul、0.5ul，（可采用倍 比稀释法），并用 PBS 将各孔补足 20ul。4、配制工作液：按 A 液：B 液=50：1 配制适量工作液，每孔 加入 200ul。5、37水浴 30min。6、酶标仪测定各孔 OD 值（ A570，Mode1）。7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。（三）SDS电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样：1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分

4、离胶的浓度。凝胶浓度（ %）分子量范围（KB）525-2001010-70155020滤纸 PVDF膜）（五）免疫反应：、5%脱脂奶粉封闭， 4过夜。、一抗孵育。、洗膜： PBST/TBST洗膜3次，10min/次。、二抗孵育。、洗膜： PBST/TBST洗膜 3 次， 10min/次。显色：将 HyGLO试剂 A 750ul 与试剂 B 750ul 混合后，均匀地滴于膜 正面，约 1min 后，抖掉膜上液体，并吸干后显色。在 Western Blotting 实验过程中使用内参的方法有：一、超级简便的标记内参使用法： 只要在二抗孵育时加入 HRP 标记 内参抗体，按照正常操作即可。二、普通内

5、参： 当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相 差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用 Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色 检测。三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较 明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质 Marker 的大小将膜剪 为大分子量和小分子量两部分， 使内参蛋白与目的蛋白分开。 然后两 块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育， 二抗温育以及 显色。丽春红染色剂是一种阴离子重氮染料， 由重氮氨基偶氮苯二磺酸 (diazotized 4-amino- 1,1 -azobenzene- 3,4

6、-disulfonic acid ) 和萘酚二磺酸( 2-naphthol- 3,6-disulfonic acid)耦合到四钠盐上。其分子式 C22H12N4Na4O13，S4分子量为 760.6 。最大吸收光谱为 520nm波长。带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合， 也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合。丽春红染色溶液是染料丽春红与蛋白质氨基基团的结合并显示 红色蛋白条带，快速、敏感、可逆地检测 PVDF膜、硝酸纤维素膜、 醋酸纤维素膜上的蛋白成分。 丽春红染色溶液性能长期稳定， 着色清 晰灵敏，可检测 250ng 以上的蛋白。丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏

7、水， PBS或其 它适当溶液漂洗去除。使用方法：1取适量丽春红染色液，用去离子水 10X稀释备用，染色液的用量， 依膜的大小而定，浸没膜即可；2将 PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中， 振荡 5-10 分钟或更长时间；3取出印迹膜，用蒸馏水， PBS或其它适当溶液漂洗 2-3 次，可出 现清晰条带，记录结果；4用蒸馏水， PBS或其它适当溶液漂洗 2-3 次，每次 3-5 分钟，去 除丽春红，进行后续的 Western 检测。Western Blot 相关试剂试剂名称说明Hanks液细胞漂洗液胰酶提取蛋白PBS溶液缓冲液、洗涤液细胞裂解液RIPA裂解细胞去离子水配制分离

8、胶、浓缩 胶聚丙烯酰胺配制分离胶、浓缩 胶Tris-HCl配制分离胶、浓缩 胶Tween 20配制分离胶、浓缩 胶十二烷基硫酸钠（SDS）配制分离胶、浓缩 胶过硫酰胺（AP）配制分离胶、浓缩 胶四甲基乙二胺（TEMED ）配制分离胶、浓缩 胶 - 巯基乙醇打开蛋白双键上样缓冲液内含溴酚蓝微量加样器加样PVDF膜甲醇活化 PVDF膜，配液封闭液（脱脂封闭蛋白奶粉）PBST/TBST洗涤液HyGLO试剂ECL发光法显色甘氨酸配制电泳液也转膜 液丽春红染色剂检测 PVDF膜上蛋 白成分蛋白电泳仪WB转膜仪切胶板附 1：溶液配制1、 胰酶： 0.25g 胰酶 加 PBS至 100ml。2、30%聚丙烯

9、酰胺：聚丙烯酰胺 29g+双丙烯酰胺 1g 见蒸馏水至 100ml3、Tris-HCl ：1.5 M ：36g Tris 加水至 200ml 加 HCL 滴定至 pH 8.8。1.0 M ：24g Tris 加水至 200ml 加 HCL 滴定至 pH 6.8。4、10% AP： AP 1g 加蒸馏水至 10ml5、5Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris 15.1g 甘氨酸 94g SDS 5g 。 使用时稀释成 1Tris-甘氨酸电泳缓冲液6、10转膜缓冲液：甘氨酸 29g Tris-HCL 58g SDS 3.7g 加蒸 馏水至 1 L 。1转膜缓冲液：10转膜缓冲液配 100ml+甲醇

10、 200ml+蒸馏水至1000ml7、10% SDS：SDS 10g，加入约 80ml 去离子水， 68加热溶解，加 去离子水定容至 100ml。室温保存。8、TBST 缓冲液： NaCL 8.8g 1 M Tris-HCl(pH 8.0) 20ml 加 入 800ml 去离子水，加入 0.5ml Tween 20 后充分混匀。 定容至 1L，4保存。9、封闭液：脱脂奶粉 5g 加入 TBST/1 PBS 定容至 1L。Tween-20【性状】聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单 月桂酸酯的混合物。【作用与用途】 为司盘和环氧乙烷的缩合物， 由于其分子中有较多的亲水性 基

11、团一聚氧乙烯基，故亲水性强，为一种非离子型去污剂。常作为水包油( O/W) 型乳化剂；可与其他乳化剂如月桂醇硫酸钠或司盘类合用， 能增加乳剂的稳定性。 也可作某些药物的增溶剂。Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做 westen blot 时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异 性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、 不结合靶蛋白 的标委、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 最常见的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、 酪蛋白、明胶和 Tween-20(0.05 - 0.1% )稀溶液。Tween 和同类型的 Triton X-

12、1OO( 聚乙二醇辛基苯基醚 )非离子型去污剂在 乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。 离子型去污剂如 SDS则破坏蛋白的结构。产品系列:吐温 20(TWEEN-20) 、吐温 21(TWEEN-21) 、吐温 40(TWEEN-40) 、吐温 60(TWEEN-60) 、吐 温 61(TWEEN-61) 、吐温 80(TWEEN-80) 、吐温 81(TWEEN-81) 、吐温 85(TWEEN-85) 。、产品简介ACR 是丙烯酸酯类( Acrylics )的缩写，也是丙烯酸酯类系列改性剂的总称， 系丙烯酸酯类的高分子共聚物。本公司生产的 ACR 为甲基丙

13、烯酸甲酯与丙烯酸 酯的共聚物，为白色可流动固体粉末。根据丙烯酸酯类的不同，所得的 ACR 性 能及用途各异，其应用范围广泛。、性能及质量指标ACR 是一种易流动的白色粉末，无毒、无腐蚀性，属非危险品，粒度较细， 真密度为 1.05 1.20g/cm3 ，具体质量指标如下： 序号项目单位201401 一等品合格品一等品合格品 特性粘数 ml/g 1.83.0 3.0 4.0 表观密度 g/cm3 0.30.5 0.40.6 挥发物含量 %,1.02.01.02.04筛余物 (0.315mm) %,1.02.01.02.0、用途ACR 作为加工助剂，可明显缩短塑化时间，加快熔融，促进塑化，对挤出制

14、 品可使其平衡扭矩提高，使其塑化均匀；对压延制品，加入 ACR 能克服表面皱 纹，有利于物料包辊，减少气泡；对于真空成型制品，加入 ACR 可提高熔体延 伸性，克服熔体破裂现象，容易深拉成型，并使制品厚薄均匀。从制品的外观来 看， ACR 可明显提高制品的表面光泽度，使制品看起来光滑细腻。本加工助剂应用范围非常广泛，除硬质 PVC 制品外，对半硬质 PVC 制品和 软质 PVC 制品均具有改进加工性能的功效，适用于需要良好耐候性的不透明 PVC 制品，如管道、建筑材料（壁板、门窗异型材、管件、百叶窗、雨水槽等） 以及注塑、吹塑制品等。四：包装 25kg 聚丙烯复膜编织袋包装。 参考资料：acr

15、 和 bis：当然是产生凝胶的最基本物质。SDS：使蛋白在胶中可以保持变性Tris-Hcl:使分离胶的 pH保持在 8.8，浓缩胶的 pH保持在 6.8 对于浓缩胶来说， pH6.8 可以通过甘氨酸和和氯离子的作用产生压 缩，从而使蛋白条带压细。对于分离胶来说， pH8.8 与甘氨酸的 pka 接近， 从而使不同分子量的 蛋白产生不同的泳动速度，从而使不同分子量的蛋白分开。TEMED 和 AP：这两种物质的作用都是催化剂WB 中的 SDS里面的原理还是比较复杂的。如果只是你的老板 为了让你理解实验，我想上面讲的这些已经够了。如果是为了考试， 你可以查查书，这样更加权威一点。TEMEDTEMED 即 N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine ， 中文名 ： N,N,N,N- 四甲基乙二胺。分子式 ： (CH3)2NCH2CH2N(CH3)2 ，分子量 为 116.20 。 外观 ：无色透明液体。熔点 ：-55 沸点 ： 120-12