基因工程7章PCR技术及其应用教学课件

1、PCR反应的模板重组质粒DNA基因组DNARNA菌落图 1 口腔腺中提取的RNAM: DL2000 marker; 1: 5 L RNA; 2: 10 L RNA; 3: 15 L RNA. M 1 2 328S18S5S2022/8/204第七章 PCR技术及其应用一、PCR技术原理二、PCR技术的主要类型三、PCR技术应用2022/8/205PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长一、 PCR技术原理2022/8/206

2、PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物2022/8/207PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCT

3、ACC3DNA聚合酶DNA聚合酶2022/8/208PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链式反应的发明2022/8/209PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana设想被人们遗忘了2022/8/2010PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链式反应。基本原理

4、是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行2022/8/2011DNA polermases for PCR:Thermus aquaticus古细菌-水生栖热菌最适生长温度70，具有5 3聚合酶活性和5 3外切酶活性2022/8/2012Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 202022/8/2013引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定D

5、NA片段2022/8/2014729455PCR循环2022/8/2015PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年, Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的

6、过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。2022/8/20162022/8/2017PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95)2022/8/2018Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and pr

7、imers anneal to target sequences2022/8/2019Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated2022/8/2020Target Sequenc

8、eTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence2022/8/2021Target SequenceTarget Sequence每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2022/8/2022被扩增的DNA片段模板

9、 DNA 变性引物与模板退火引物延伸模板DNA变性引物与模板退火引物延伸引物延伸循环1循环2循环3模板 DNA 变性引物与模板退火21222423825次循环后，被扩增的DNA片段的拷贝数为 225 附图Target AmplificationTarget Amplification2022/8/2023No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cyc

10、le = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon2022/8/2024PCR反应体系缓冲溶液(Mg2+是DNA聚合酶的激活剂) 耐热DNA聚合酶脱氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs)模板DNA或cDNA上游引物、下游引物2022/8/2025（1）PCR反应缓冲液Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓

11、度影响反应中游离的Mg2+浓度。2022/8/2026（2）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-5 U/100L 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。2022/8/2027（3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等,一般为50-200mol/L 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。2022/8/2028（4）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/

12、100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。2022/8/2029（5）引物浓度 0.1-1mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。PCR引物的设计一般原则引物长度一般以1530bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在4555%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。2022/8/2030要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡

13、结构。引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引物效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。2022/8/20312022/8/2032例 1. 引物的 3 末端形成杂交 5 GGCTATACCGATTCGAATCA 3 3 ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5例 2. 引物的 5 末端形成杂交 5 ATCGATCGATGGCATGGTAT 3 3 TATGGTACGGTAGCTAGCTA

14、5例 3. 引物的中间部分形成杂交 5 AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3 3 AACGAGCTTCGATGGCTAA 5例 4. 5 CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3引物设计软件：Primer 5, Oligo6目的基因上游引物设计目的基因下游引物设计2022/8/2041PCR一般循环参数变性 使双链DNA解链为单链,95 35分钟(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定, 适宜的退火温度大约低于引物Tm值45-55 ，介于45-55 。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温

15、度。 Tm（）（）2022/8/2042（3）延伸 72，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加标准的PCR反应条件：10缓冲液 10 L4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5UMg 2+ 1.5mmol/L2022/8/20432022/8/2044PCR仪2022/8/2045模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/8/204650引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过

16、程PCR的特点2022/8/2047引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/8/204872第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/8/2049955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/8/205072第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/8/2051重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷

17、贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 附图PCR反应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分2022/8/2052PCR反应的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位） 细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24 h完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的

18、粗提DNA2022/8/2053空斑形成单位又称蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位互换。用PFU计量病毒的方法叫作PFU法。 1、反转录PCR(RT-PCR) 2、反向PCR 3、复合PCR 4、不对称PCR 5、嵌套PCR6、3Full RACE7

19、、5Full RACE8、实时定量PCR2022/8/2055二、PCR技术的主要类型 1、反转录PCR(RT-PCR) 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。2022/8/20562022/8/2057反转录酶具有依赖于RNA的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性， AMV(42)和MMLV（37）。双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链2022/8/20582022/8/205953AAAAA5353355

20、33553RT-PCR 原理mRNA1st cDNA反转录酶、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5533特异 PCR 产物5533经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝55332022/8/2060MLV RT催化的 cDNA合成RT-PCR引物选择2022/8/20632、反向PCR (reverse PCR) 是用反向引物对某个已知DNA片段两侧未知序列进行的PCR。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA。已知序列未知序列未知序列2022/8/2064已知序列未知序列

21、未知序列限制酶限制酶连接酶2022/8/20653、复合PCR(或称多重PCR)在一个反应体系加入多对不同的PCR引物同时扩增，获得多个PCR产物，这种PCR称为复合PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物2022/8/20664、不对称PCR 是指用不等量的一对引物产生大量单链DNA的PCR。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途： 制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究2022/8/2067 高浓度引物低浓度引物5、嵌套PCR(或称巢式PCR)是指先后用两套引物进

22、行扩增的PCR。用第一套引物扩增1530个循环；再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增1530个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增。2022/8/20686、3Full RACE7、5Full RACE5-flanking region of chicken ovalbumin gene 8、实时荧光定量PCR(real-time PCR):美国PE（Perkin Elmer）公司2019年研制出来的一种新的核酸定量技术。通过特定设计的PCR仪器检测PCR扩增过程每一轮循环产物标记的荧光信号累积数量，从而进行实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,称为实时荧光定量P

23、CR。以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。 2022/8/2076（1） SYBR Green I 检测模式通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链 DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在

24、科研中使用比较普遍。2022/8/2079（2） 水解探针模式（Taqman探针） 发射基团荧光淬灭基团53该探针可与扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5端标以荧光发射基团,靠近3端标以荧光淬灭基团,探针3端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。2022/8/20802022/8/2081工作原理是利用Taq酶的53外切酶活性。在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，它与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。探针的5端标记荧光发射基团(荧光发射峰值在518nm处)，3端标记荧光淬灭基团 (荧光发射峰值在582nm处)且被磷酸化，以防止探针3端在PCR扩增过程中被延伸。202

25、2/8/2082当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当Taq酶移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。2022/8/2083实时定量PCR法检测Lj-HMGB2基因在各组织中含量2022/8/2085三、PCR技术应用1. 基础研究基因或 cDNA 克隆：

26、从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 核苷酸序列, 用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。2. 医学感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核杆菌、乙肝病毒等。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。恶性肿瘤的诊断。2022/8/20863. 法医学中的基因和亲子鉴定DNA 指纹图谱 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为DNA指纹，意思是它同

27、人的指纹一样是每个人所特有的。AATG7 repeats8 repeatsAATGAATG引物引物引物引物简单序列重复(SSR)实验方法 现场 嫌疑人1 嫌疑人2 嫌疑人3法医鉴定案例一母亲 儿子 男性1 男性2 男性3亲子鉴定案例二4. 考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定5. 基因动、植物的检测转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因植物的检测：玉米、大豆等。物种进化图2022/8/20941、要求将下面基因片段克隆至表达载体pET-28a相应位点上，并获得此基因的表达。 ATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG

28、 GAC CAT GGT TGG TAT TTA GCT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT CAA GCT TAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA TGG