食品药品检验检测中心分子生物学平台建设项目策划书

1、食品药品检验检测中心分子生物学平台建设项目书尊敬的领导:感谢贵单位给我机会向你们介绍分子生物学平台建设方案,该分子平台包含CR电泳成像系统、荧光定量C仪、微滴式数字PCR系统、全自动病原微生物检测系统、脉冲场电泳系统，以及酶标仪洗板机、蛋白纯化系统、细胞分选系统等，通过有机结合,技术互补,实现目前行业内最领先最专业的分子检测技术，为食品药品安全提供整体的解决方案。该分子平台可开展的应用与研究方向包括但不限于:、病原微生物快速检测、活菌定量检测、致病菌溯源2、动物源性成分的定性与定量分析3、转基因成分的定性与定量分析4、中药材的真伪鉴不、生物制品的检测6、药物安全评价7、检测新技术的研究及试剂盒

2、的开发等目 录O o1-8 z u 一、分子平台应用实例 PAGEREF _T33940 3、食源性致病菌快速检测 PGEF _Toc33940645 h 32、致病菌活菌定量检测7、致病菌溯源104、动物源性成分检测15、肉类及肉类制品中的成分掺假和虚标96、转基因成分定性与定量检测237、中药真伪鉴不、生物制品检测79、药物安全评价43二、要紧仪器介绍41、PR电泳成像系统442、CFX96 Tch型荧光定量P系统453、QX00微滴式数字PR系统44、Q-Check全自动病原微生物检测系统7、脉冲场电泳系统46、蛋白纯化系统47、细胞分选系统三、分子平台推举规划51四、分子平台推举配置5

3、2一、分子平台应用实例1、食源性致病菌快速检测背景介绍民以食为天，食品作为人们日常生活中不可或缺的一部分,它的安全关系到人类的生命安全和生存进展，而食源性致病菌是威胁到当前食品安全的重要因素之一。尽管近年来由食源性致病菌引起食物中毒事件的报道数量有所减少,然而据美国C公布的检测报告显示，实验室检出食源性菌如沙门氏菌的概率并没有降低，因此食源性致病菌对公共健康的威胁仍不容小觑1。传统检测方法尽管是食源性致病菌检测的“金标准”,但因其操作繁琐,需要耗费大量的人力、物力和时刻，专门难满足基层日常检测和执法需求。特不在我国,一方面食品需求数量巨大，另一方面食品的加工生产却呈规模小、零散等特点,因此要保

4、证我国民众的食品安全，提高抽样覆盖率是十分必要的。假如使用传统的检测方法,不管从时刻上依旧经费上都无法满足食品抽检的需求。因此，有必要研发和普及一些检测速度快、费用低、灵敏度高的快检技术来更好地应对和操纵食源性疾病的爆发。检测技术目前,文献报道的食源性致病菌快检技术有专门多,例如:免疫学检测技术、代谢学检测技术、分子生物学检测技术、生物传感器检测技术等。不同的检测技术各有特点，然而能满足检测速度快、费用低、灵敏度高、操作简单等特点,并适用于基层执法和检测需求的技术要紧为免疫学检测技术和分子生物学检测技术。其中，免疫学检测技术具有较好的特异性、灵敏性，检测效率高、费用低,对人员要求较低且不需要大

5、型仪器等特点，因此目前应用得最为广泛。然而免疫学检测技术也具有一定的局限性:例如当待测样品中含有目标物的竞争性物质时，专门可能会出现假阳性的检测结果；免疫学检测对反应体系环境要求较高，错误的选用试剂会直接造成检测失败等。随着分子生物学技术的飞速进展,目前差不多能够实现在分子水平上对食源性致病菌的鉴定。其中最为便捷、快速和适用广泛的鉴定技术要数聚合酶链式反应技术(polymrse hain eaction,PCR）。CR技术起源于20世纪0年代，由美国的Kay Mullis发明。PCR技术要紧是在体外合适条件下，以DNA(或R）为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物在耐热DNA聚合酶作用下特异性

6、扩增目的DN片段的技术。整个反应由20-45个循环组成,每个循环均包括高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤。近年来,用CR技术检测食品中食源性致病菌的方法有专门多种，如常规PCR、不对称PCR、免疫PC、套式PCR、荧光实时定量CR（qPCR）、多重PCR、逆转录PCR等。2005年,范宏英等2运用多重R技术成功的将沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O15、绿脓杆菌和副溶血弧菌5种饮用水不得检出的致病菌同时快速检出。2010年,程晓燕等3建立的BR Gren I实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒的方法,取得了较好的实现效果。目前，基于Taqman探针的荧光实时定量PR检测技术差不多被广

7、泛应用于食品性致病菌的检测中，并制订了相应的检验标准。在2016年新公布的食品安全国家标准 鲜(冻）畜、禽产品（GB 277-016)等12项食品安全国家标准中，同样涉及到了PCR及qC的检测技术。因此,在前增菌和选择性增菌后，应用CR技术能够对样品中是否含有食源性致病菌进行检测，这种检测技术的优势在于检测效率高、特异性好以及灵敏度高等。标准编号标准名称SN/T159.72010进出口食品中沙门氏菌检测方法 实时荧光PCR法SN/T 87-2007食品中致病菌检测方法 实时荧光PCR法S/ 41-2010进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法 实时荧光PCR法GB 789.-01食品安全国家标

8、准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验B48.2201食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验G 4789.4216食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验表1.基于PR技术进行食品致病菌检测的部分行标和国标伯乐解决方案美国伯乐（B-ad)公司作为生命科学领域的领先者,一直致力为众多科学家解决实际科研应用问题,提供全套解决方案。所推出的i-Check全自动病原微生物检测系统，包括核酸提取及通过认证的定量检测试剂盒、自动化工作站(可选）、定量PCR仪器和专业的分析软件,仅需一步增菌,在8-24小时内获得结果，为致病菌快速、准确检测提供了最佳解决方案,其具体特点如下：

9、检测项目:配套8种常见的致病菌检测，包括：沙门氏菌、大肠杆菌O57:7、产志贺毒素大肠杆菌、对O族的大肠杆菌进行确认和鉴定（检测个要紧的血清型:O157：H7，O111，O26，O13,O145,O4，1)、单增李斯特氏菌、李斯特菌属、弯曲菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌、阪崎肠杆菌、军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母菌；其中军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母可进行定性和定量检测;对市面上其他厂家各种致病菌检测试剂盒兼容性好；检测兼容性：多种致病菌和检测项目可同时同机进行;检测性能：检测中含内标质控和阳性对比,内部质控指示没有假阴性反应,有效幸免检测的假阴性,所有检测项目都为qn探针;病原菌NA提取:专利

10、的提取流程至少提取100ul增菌液,无需离心，一步即可提取DN,提取时刻分至30分钟。且可整合最新的FreDNA去除处理方案,有效去除食品中死菌DN干扰，尤其适合通过辐照、巴氏消毒处理或以噬菌体作为加工助剂等类型的食品样本;仪器开放性：此检测仪为开放性操作平台，厂家配备的检测试剂盒在2-2小时检测目标菌;非厂家配备试剂检测时刻可能会有所延长；检测灵敏度：检测食品仅需一步增菌,检出限1CU25g；检测通量：94个样本加上2个对比；定量PR仪特点：6通道检测，配备触控屏，可单机操作;定量PR仪温度操纵:具有动态温度梯度功能，能够同时运行8个不同的温度；定量PC仪温控准确度：0.2；温度均一性:.4

11、;定量PR仪最高升降温速率：2.5/秒;认证认可：软件分析系统及试剂获得AOC、AFNOR等国内、国际认证，结果自动判读：直接读取“有”或“无”的结果；扩展使用:除可用于致病菌检测外,本系统还可应用于核酸定量、基因表达水平分析、基因突变检测、MO检测及产物特异性分析、流行病学试验等多种检测、研究领域；数据分析:能够对病原微生物进行定性和定量检测，并可进行标准曲线的绘制，并有中文软件及免费升级；质控功能:每份测试的试剂内均自带质控功能,仪器能直接确认每一份测试的试剂质量 图1. Bio-Rd iQ-he全自动病原微生物检测系统 图2. iQ-Chec手动及自动病原微生物快速检测流程erencea

12、kthvathsalm P,Rajendrn VK， Saran U, et a.Immunomgtic nanparcle bsd quantitative PCRor rapi dttinf Slonella .Micrchim Aca,213， 1：12411482 范宏英, 吴清, 吴若菁, 等. 饮用水中5 种致病菌多重P技术检测研究J. 微生物学通报, 205, 3（):102-07. 程晓燕, 刘庆慧, 黄捷. 实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法的建立J 安徽农业科学, 20, 38():1426-1426.、致病菌活菌定量检测背景介绍从前面我们明白，食源性致病菌检测关

13、于食品安全检测的重要性，而关于食品中活菌的定量检测才能真实反映出该样品的污染水平,因此如何幸免一些通过辐照、巴氏消毒等处理后的样品中死菌的干扰而仅定量检测活菌含量就显得至关重要。传统方法如分离培养法等不能满足快速检测的目的，而现有的致病菌基因检测方法如一般PC、等常常无法有效识不食品中的活菌和死菌,导致假阳性的结果。因此开发快速、准确的定量检测活菌的方法专门有必要。检测技术目前,研究者们利用活菌和死菌细胞膜完整性不同,开发了EA-qPCR/PCR和PMA-qPCRPR法。其中，叠氮溴化乙锭（EMA)和叠氮溴化丙锭（PMA）是一种结合能和N共价交联的光敏材料，光照能够使E/PM的光敏基团转化为氮

14、宾自由基,其能够和DNA发生共价交联，进而阻断DA分子的C扩增,同时这种染料只能选择性的渗透死菌的细胞膜,因此可被用于和PC技术相结合定量检测活菌。然而有研究发觉,EMA具有细胞毒性，可进入部分活性细胞内阻碍检测结果，其应用受到限制,因此目前研究中更多采纳无细胞毒性的PMA染料结合PCR法定量检测食品中的活菌含量1，2。除了qP技术外，数字PCR技术（digital lymeas cin reato,dPC)是近两年来新兴的生物分子检测技术，以一种全新的方法进行核酸分子的灵敏检测和绝对定量,与传统PCR、定量CR相比,其结果的精确度、准确性和灵敏度均有大幅度提升，被称为“第三代PR”技术,标志

15、着PC技术以后进展的方向。伯乐解决方案：结合PMA处理的微滴式数字PCR法美国伯乐公司作为数字CR技术的开拓者和领导者,开发和研制了最新型的QX200微滴式数字CR(dropet digita PCR,dCR）系统,其技术原理是可将核酸模板、引物探针等组成的荧光PR反应体系均一等分为近2万份纳升级稳定的“油包水”微滴(微反应单元),等于将有限的目的模板进行近似于无限的稀释分开，在通过PCR扩增之后，含有模板的微滴会检测到荧光信号，其余微滴无阳性信号。依据阳性液滴与液滴总数的比值,可按泊松分布规律推算出反应液中目的模板浓度,实现核酸检测的绝对定量。数字PCR技术以其准确性好、灵敏度高、无需任何外

16、参校准物质、可对样品核酸进行绝对定量等优势，差不多在临床诊断、单细胞基因表达、环境微生物检测、二代测序结果验证和食品安全定量检测等方面得到了广泛的研究和应用。图1. - QX200微滴式数字PCR系统商业化数字PCR仪的出现,克服了研究者们各自研究工作中操作复杂、重复性差、通量低等困难，实现了自动化和高通量的应用，从而进一步的推动和扩大了数字PC技术的进展和应用范围,在食品安全检测领域获得了广泛的关注、引起了极大的研究热情并差不多取得了可喜的成果。董莲华等3用dCR建立了大肠杆菌O57：H7的定量检测方法，定量检测限为4 cop/0ul，定性检测限为3opis/20ul。Rthrok等4将dd

17、PR与禽类加工行业现有常规两种检测方法PCR和传统培养鉴定方法进行了比较，研究了在采纳不同取样时刻和取样方法时这三种检测方法得到的禽类加工设备中要紧传染性致病微生物检测结果的差不。结果表明,PR能够从更早的从样本中，也能够更多的从不同的生产加工设备中检出病原菌的特异性基因,且定量检测结果与传统的病原菌培养鉴定检测方法一致。在食品致病菌活菌检测中，威海及山东出入境检验检疫局的王静等,首次将PMA与C技术相结合,开发了高灵敏、高选择性的检测食源性致病菌的新方法。能够在死菌存在的条件下定量检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌活菌，消除了“假阳性”结果的出现，利用脱氧胆酸钠（S)对样品预处理，使得更容

18、易穿过死菌细胞膜。D-PMAddR整个过程快速简便,成功检测鸡肉等样品中沙门氏菌及单核细胞增生李斯特氏菌的含量(最低检出限为 copies/20ul体系)。与基于qCR的方法相比,具有准确度高、灵敏度高、不需要建立标准曲线等优点。伯乐解决方案：iQ-heckFreeDA去除方案另外一种活菌检测的解决方法确实是前面提到的iQCheck食源性致病菌检测方案中采纳的死菌Fee DA去除方案，其原理是试剂盒中有一种可选择性识不游离N并将之降解的酶,只需在裂解细胞提取DNA前用此酶和相应缓冲液于37处理样品15-0分钟即可极大消除死菌A干扰，随后加入裂解液可失活此酶,不阻碍后续活菌D的提取。较之PMA处

19、理法，该方法能够极大地简化操作,提高效率,且易于整合进iQ-Chck病原微生物检测流程中。采纳此方法处理后平均可降低源自死菌游离DNA的2-3个数量级(约个Cq值)的结果干扰，极大地降低了假阳性结果的出现,为食源性致病菌活菌检测提供了便捷而有效的解决途径。图2. iQChecFree DA去除方案原理及流程表 比较不同含量李斯特死菌在经Q-Chk Fr A去除处理前后的检测结果差异Rern於颖,王文静，陆晔. PMA-qPC定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究J. 检验医学,015， 30(5）: 500-06.2徐义刚,李淑云,鞠文东,等. PM结合定量P方法检测食品中活性志贺菌的研究.黑龙江

20、畜牧兽医，201， 07:2-28.3董莲华， 张玲, 姜君,等. 大肠杆菌O157:H7微滴数字PR定量方法的建立J 分析化学, 215, 43（3）： 319-324. 4 Rhroc M J,iett K , Kiepper B H, etal.antifiion o ZoonticBacterl athges wtin Cmmercil ultry Prcesing Water Sales Uing Drlet Digial J. Adncesin irobiology, 21,03(05):403-4115 王静, 张慧敏, 魏玮, 等 D-PAdPC检测食品中沙门氏菌的研究 J.

21、食品工业科技,206, 37(10): 67-.王静, 刘玉敏, 李春喜, 等 M-PCR检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌J. 微生物学通报, 201(1).3、致病菌溯源背景介绍由细菌、病毒、真菌等通过食物、环境接触等方式传播引起的感染性疾病，是食源性疾病中最重要的组成部分,每年在全世界爆发的食源性疾病中,由细菌等导致的感染占90%以上，严峻阻碍、危害公众健康。同时,随着全球贸易往来、旅游等活动日益频繁，该种感染经常呈现出跨国家、跨地域、跨省市的多地点、大范围的爆发,成为一种世界范围内的公共卫生问题。因此,在快速确认致病菌种类的同时，及时对致病菌进行溯源分析是一项特不迫切而重要的任务。只有找

22、到了致病菌的来源，相关部门才能在源头上进行部署和操纵，才能幸免感染或中毒事件的进一步爆发和扩散。针对上述问题,美国CDC于199年开始建立PusNt系统并成功应用。该系统在暴发流行病的识不、分析、预警和改善加强操纵措施中发挥了重要作用。在200年美国毒菠菜事件中爆发的大规模O:7型致病病菌感染，确实是利用了PlsNe快速鉴定和溯源的。美国ulseet在28-2009年花生酱污染鼠伤寒沙门菌暴发疫情中,迅速查明传染源，召回问题食品,有效操纵疫情蔓延（1),PulseNet因此被列为21世纪公共卫生领域最具阻碍力的创新之一,获得美国科技创新奖（2）。我国在20年9月正式启动了useNEChi。在2

23、00年C群流脑暴发处置和25年猪链球菌感染暴发处置的过程中,Plseet hia都起到了特不大的作用。技术原理与实验流程ulseNt系统利用标准化的PFE(Psed-Field l lerporsis脉冲场电泳)技术，在实验室即可得到某种菌株或其亚型的分子分型的图谱,比如大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弯曲杆菌和霍乱弧菌等,该图谱能够以图片的形式上传和分享，通过图谱中显示的差异条带与特异条带,就能够与useNT数据库中成千上万个类似的图谱进行比对。通过分布在各地的网络实验室的实际检测结果，建立网络平台及时交流和比对数据,如此就能够对不同时刻、地点爆发的疫情中得到的不同的分离株同

24、时进行分析,从而评估食源性传染病发生的关联以及调查和快速鉴定暴发的来源(图1)。 图1，致病菌溯源分析示意图PFE技术是用于分离大分子量NA片段的一种电泳方法。仪器交替改变电场方向,大片段D在凝胶中不断重新定向,DA分子越大，重排所需要的时刻越长,DNA分子越小，所需时刻越短，据此就能够按其大小分开(图2)。图2，脉冲场电泳原理示意图利用限制性核酸内切酶，将基因组N酶切成有限数目(12）的大分子量限制性片段之后，通过F使这些限制性片段彼此分离,形成电泳图谱。由于不同菌株的电泳图谱具有高度特异性,从而识不特异的菌株。PFE检测技术具有敏感、特异、分辨率高等特点,同时在实验操作中结果稳定、重复性好

25、、已易于标准化,因此被称为细菌分子分型的金标准,也是目前世界上最为成功推广的技术。世界各国的疾控系统在建立和使用G技术的过程中,绝大部分差不多上使用BIO AD公司的脉冲场电泳设备和成像系统。CHEF MapeXA系统是市面上最先进的脉冲场凝胶电泳系统，能够用在所有PE相关应用领域中。它将CE、PACE、DR、FG和AFE多种技术结合在一起，还能够提供“多矢量”功能和“二次脉冲”程序，使我们研究的所有片段大小范围的DNA分子都能得到最佳分离。 FGE的实验流程如下(图3）：菌株分离和接种。在实验前一天做好菌株的平板培养，备用。制备小胶块Plug。挑取适量的菌体,用细胞悬浮液进行悬浮,同提早配置

26、好的胶溶解在一起，利用模具进行灌胶，待胶凝固后，取出小胶块。细菌裂解。将小胶块放入提早配置好的裂解液中，在摇床上进行细菌的DA裂解过程。胶块清洗。利用灭菌水将胶块反复清洗。胶块内N的酶切。选取特定的内切酶,对胶块进行酶切。电泳。先将小胶块切成合适大小后贴在电泳梳底端边缘，然后进行灌胶，胶凝固后将梳子拔出即可。在电泳设备上设置好电泳的程序,将胶放入电泳槽,即可进行电泳实验。图像猎取。电泳结束后利用成像设备对电泳结果进行拍照保存。利用数据分析软件进行胶图的进一步分析。图3，脉冲场电泳实验流程电泳结束后，通过成像设备，我们能够得到检测样本的胶图(图4左)，将该胶图导入数据分析软件之后，能够同其他样本

27、的胶图进行分析比对,得到聚类分析的结果(图右)，进行溯源分析,确认该次致病菌的爆发源头。图4，脉冲场电泳实验流程案例(1)208年，黑龙江完达山药业的刺五加注射液由于细菌污染,导致3人死亡，多人出现严峻不良反应,PFGE的方法在该起事件溯源调查中发挥了重要的作用。(2)201年,德国爆发了由肠出血性大肠杆菌O104:H4感染的 “毒黄瓜”事件,后蔓延至16个国家,5人死亡,400多人受感染，PFGE分型对该事件的溯源分析提供了最可靠的实验室证据。(3)2006年0月，美国爆发“毒菠菜”事件,共有26个州199人感染，其中102例(51%)住院,31例(16%）进展为肾衰竭，3例死亡。通过GE的

28、方法最终确定“自然选择”食品公司袋装菠菜中的O15:7为此次大肠杆菌感染事件的元凶。Referenc()PeliL, ElsnR， Ltl C et l., nternaionaotbreaof Salmnelenftenerg in 00. Ero Srvell2007;12(4):pii=218.31 l 2008. (2)LetuchtA, Reaer M. asetro tudy f Slmonel partphi infection asociatd wirvel to nya, urkey: ue. urSrveil. 19;3(44):pi=137 Augut00 、动物源性成分

29、分析背景介绍“动物源性成分”的检测一直以来差不多上检验检疫部门的重点检测项目,直接关系到饲料安全、食品安全等公众健康热点问题。动物源性副产品因富含蛋白质、钙等营养成分而被应用于畜禽饲料中,但现有证据表明,在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或感染过痒病因子的牛羊肉/肉骨粉后能够引发和传播疯牛病（BE）,我国差不多制定了多个关于动物源性饲料生产治理的相关条例。另外，在食品领域，关于动物源成分的检测也是必不可少的。古有“挂羊头卖狗肉”,而今,食品掺假、肉类掺假等丑闻在世界范围内层出不穷，比如213年欧洲发生的“马肉风波”震惊全球，而在中国，各种肉类造假的新闻更是不绝于耳，屡见不鲜,“牛肉膏”制造

30、假牛肉,鸭肉制成“涮羊肉和烤羊肉”，还有“假肉丸鱼丸”,遍布大小集贸市场、餐饮饭馆，乃至深受消费者信赖的知名超市， “掺杂使假”可谓无孔不入。综上所述,对动物源性成分的检测是关系到食品安全、民众健康的重点检测项目,必须严加执行。依据当前实施的国家标准、出入境检验检疫行业标准,利用PCR技术、电泳、成像系统,以及荧光定量PCR系统，可实现食品及饲料中多种常见动物源性的快速检测(如表1）。近些年,随着技术的不断更新,一些新的检测方法如微滴式数字PCR技术也越来越多的被应用于动物源成分的检测项目中来，其检测结果及发表文献受到了多方关注，正逐渐成为检验检疫部门的 “新宠”。动物源性成分分析的经典检测方

31、法 要紧优势：1. 操作简便，简单培训即可掌握2.日常使用成本较低3.开放的平台，兼容性高性能要求：1. 能一次处理1-96个样品2. PCR每管反应体积可达0.2mL3. 支持不同反应条件同步进行，可同时运行8个不同温度4. 20分钟内可完成单次PCR扩增反应5. 凝胶成像系统具备足够的分辨能力，CCD分辨率达1360 1024定性PCR法平台的要紧组成：热循环扩增仪电泳仪凝胶成像系统 定性PCR法用于源性成分的分析是目前最为常规的检测技术，在现有的国家标准体系统中是各类成分鉴定鉴不的要紧手段之一。该方法适用范围广，加上操作简便及成本较低的特点，使得其在各级检测实验室中普遍使用。基于不同物种

32、成分具有各自独特的核酸序列，一般PCR法能够轻松实现各类源性成分有无的定性分析，然而不能进行定量分析。 要紧优势：1. 操作简便2.日常使用成本适中3.闭管设计，减少实验室污染的可能性能要求：1. 能一次处理1-96个样品2. 开放的平台，兼容性强3. 多个通道，能够满足多组引物的同时检测4. 40分钟完成扩增全过程 在过去的几年中，实时荧光定量PCR法进展迅速，在现有的国家标准体系中，也陆续有相关的检测方法出台。该方法能够直接定量分析，和常规的定性PCR法互为补充，共同满足源性成分分析的检测需求。 实时荧光PCR方法能够在单台仪器上完成从PCR扩增到检测结果分析的全过程，操作上更加简便。Bi

33、o-Rad 的实时荧光定量PCR 平台，提供全中文操作软件，在操作上更加符合国内客户的使用适应。仪器采纳触摸屏设计，可在单机上完成各项操作而无需外置电脑。此外，该仪器性能稳定，即使搬运也无需额外的校准，适用于各类卫生应急事件的快速响应。 微滴式数字PCR技术是近几年兴起的第三代PCR检测技术。该平台的原理是：将PCR反应液进行油包水的微滴化处理，形成约2万个纳升级的微滴，每个微滴里均可进行一个PCR反应，最后将所有微滴逐个通过检测器进行荧光信号检测，最后通过推断微滴的阴阳性来推断样本的浓度是多少拷贝。事实上验流程要紧包括反应液配置、生成微滴、PCR、检测微滴、数据分析这几个步骤。 这种最新的技

34、术无需任何标准品就能够直接对样本进行定量分析，软件自动显示样本中某种动物源成分有多少个拷贝数，最低可检测单拷贝，关于含量极低的样本同样能够稳定检出，且该方法对对样本质量及扩增效率要求不高。 性能要求：1. 能一次处理1-96个样品2. PCR每管反应体积可达0.2mL3. 支持不同反应条件同步进行，可同时运行8个不同温度4. 20分钟内可完成单次PCR扩增反应5. 凝胶成像系统具备足够的分辨能力，CCD分辨率达1360 1024要紧优势：1.无需标准曲线，实现绝对定量2.实现超高灵敏度或高通量的样品分析3.兼容 TaqMan 探针或 EvaGreen成功案例：德国根特大学的科学家Floren等

35、人将数字PCR技术用于动物源性成分的定量检测。研究结果显示，将两种不同动物的基因组DNA按照不同比例进行混合后，利用微滴式数字PCR平台，质量百分比定量检测限和定性检测限分不能够达到0.01%和0.001%。上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心潘良文主任实验室最近表的文章中，采纳微滴式数字PCR平台建立了一种新的检测方法，利用该方法能够在肉制品的重量(mg)、DNA重量(ng)及特定目标基因的拷贝数(copies/ul)之间建立良好的线性关系，进而检测肉类样品中猪肉和鸡肉的准确重量及含量，并利用上述方法对超市中买到的11种不同的肉制品其中鸡肉和猪肉的比例进行了实测，得到了专门好的结

36、果。标准编号标准名称B/T2019206饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（CR）法GB/T 2101-207动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PR方法GB/T 2110-2007动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法 实时荧光PC方法B/T 21320动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法GB/T2104-07动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛，羊，鹿)定性检测方法 PR方法G/ 115-20动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法 PCR方法G 21106207动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法 PCR方法G/T 21107-2007动物源性饲料中马、驴

37、源性成分定性检测方法 PC方法G/ 2565-2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法N205208食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法_实时R法SN 2557-2010畜肉食品中牛成分定性检测方法 实时荧光PCR法SN/T 27-201动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法S/T 730.1-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第1部分:貂成分检测 实时荧光PCR法SN/T 3730.2-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第2部分:狗成分检测实时荧光PCR法N/ 3730.3-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第部分:狐狸成分检测实时荧

38、光PCR法SN/T37.-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第4部分:驴成分检测 实时荧光CR法SN/T 7305-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第5部分:马成分检测 实时荧光CR法N/3730.6013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第6部分:猫成分检测 实时荧光PCR法SN/T 730.72013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分：水牛成分检测 实时荧PCR法SN/T 730.8-203食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第8部分：猪成分检测 实时荧光C法SN/731.1-01食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第部分:鹤鹑成分检测R法ST3731-2013食

39、品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第2部分：鹅成分检测P法SN/T 3313-21食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第3部分:鸽子成分检测实时荧光PC法SN/T 3731.401食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法S/T3731.-213食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分:鸭成分检测 PC法SNT 373.6-21食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第6部分:鹧鸪成分检测 实时荧光PC法表1，动物源成分检测的部分标准和方法eferenceCFloren,iedemnn，B.Breg eal.， siesidentificionand quntific

40、tinin atand meat proucts usidoplet diitalPCR（ddPCR);Food Chemtr173(25)14-10.Ca, ，.v et al., Quanitativ Analis of ork d Ccen routsbyrple DigiP；ioMed Rserh teatinal olum 04. 5、肉类及肉类制品中的成分掺假和虚标背景介绍当前，关于研究者、消费者、食品工业和政策制定者而言,食品安全差不多上一个热点问题，尤其是肉类掺假和成分虚标的问题。23年“欧洲马肉事件”和“沃尔玛狐狸肉事件”等一系列的肉类掺假事件为肉类安全敲响了警钟,成分虚标更

41、是存在于高达20%的食品检测案例中(Balli et al., 09)。食品安全是食品药品检验检测中心的一项重中之重的工作，因此如何快速有效的检测肉类掺假及成分虚标是需要解决的首要任务。检测平台与技术路线目前，对肉类样品进行分子检测的技术分为两大类:DN分析和蛋白质分析。蛋白质分析要紧有EIA、C等方法，然而由于灵敏度不高、操作复杂等特点其推广应用受到了专门大的限制；DNA分析要紧有琼脂糖凝胶电泳分析(定性分析）、荧光定量PC（qPC）以及近几年受到广泛关注的数字CR技术(PCR)。本部分旨在通过介绍以LIA、qPCR以及dPCR为基础搭建的检测平台,为检测工作提供更多简便灵敏的可选方案。EL

42、IA检测平台（适用于所有的肉类制品)检测背景:肉类成分鉴定的方法较多,其中EISA的灵敏度相对较高,特异性好,而且操作相对简单，易于推广。本文旨在建立通用的ELISA检测平台以进行肉类成分鉴定。 检测平台：Coed Meapcis dentiicatinKt (ELIS-TEK, Gainevlle,FL)及鉴定物种相对应的单克隆抗体。检测流程：将100种生鲜肉类和熟食样品称取25在水中搅碎并进行搅拌，直到无块状物；将混合物100加热5 in，滤出不溶物后用kt和单克隆抗体进行检测。检测结果：检测试剂盒的OD为1。LISA方法能够特异性的鉴定各种肉类掺假成分。Bi-R解决方案：Bio-ad提供

43、xMARK、iMARK等不同系列的酶标仪产品，体型小巧，操作简单，同时具有强大的数据分析能力，能够为日常的LISA工作提供更多的关心。另外,io-ad同时提供WesternBlotg全套的3解决方案，为蛋白质印迹研究提供简洁便利、定量精确的工作平台。qPR检测平台（以牛肉和猪肉为例）检测背景：常规的检测肉类成分的手段包括LIA、PAGE和PAGIF等蛋白质分析技术,但由于肉类样品加热后蛋白质变性而难以检测出细微的成分区不；本研究试图建立高效、灵敏的R检测平台，以作为实验室常规检测手段。检测平台:qR平台。牛肉检测以磷酸二酯酶基因(osPE）为检测位点,扩增子长度为04bp,猪肉检测以ranoi

44、n gene中的108b的片段（suR)为检测位点。检测流程:待检测样品用改良的CAB方法和蛋白酶K进行处理,最后溶解于0l的TEBuffr中。分不以M标记susRY和bosE,进行qPCR检测。检测结果:两种检测体系的LOD均达到了0.1%(/),超过绝大部分的蛋白质分析法;当检测猪肉时,假如制品里含有超过1(w)的土鸡肉时,会出现非特异性扩增，但其他情况特异性均特不行,因此能够作为肉类成分的常规检测手段。io-Rad解决方案:FX o系列荧光定量PCR仪具有精确、快速、灵活三大优势，切实解决日常工作中核酸定量的繁琐操作、性能不稳定等缺点。精确：长寿命LED光源和一体化检测器,寿命长，性能稳

45、定，扫描模式无光程差。快速:快速升降温,支持fas CR;即插即用,无需校正;温度梯度功能,快速优化实验条件；真正5通道(450-70nm)检测。 灵活:可实现多台仪器连接;真正单机运行，实时显示,可储存00个结果。ddPCR检测平台 检测背景：现有荧光定量PC方法用来做绝对定量,然而因为DNA扩增效率和扩增质量在对比和检测样品间存在差异，因此其应用受到专门大限制。检测平台：本文献报道的ddPCR以g的2基因为标记,采纳拷贝数百分比的方法评估肉类及制品中的物种成份。检测流程:待测样品采纳改良的CAB方法及加热方法进行N提取，后续采纳ddPC对线粒体CY基因和基因组中的F2基因分不进行dCR检测

46、。检测结果:相比现有的qPC手段,ddPCR的检测下限和定量下限分不达到0.00%和.0%的水平；之前的物种鉴定方法通常以线粒体NA上CYT基因为标记，然而假如要定量分析物种成份,以线粒体为靶标往往会得出过高或过低的结果（偏低7至偏高60）,这是因为不同组织细胞中线粒体拷贝数差异极大，而F2基因是更合适的检测靶点。检测背景:肉类检测中，qPR由于其依靠于扩增效率及标准曲线的特点应用受到了极大的限制,本文献致力于进展利用数字PCR建立完整的检测平台，以揭示dPCR结果与成分含量之间的关系。检测平台:ddCR检测平台。猪肉检测是以 So beta-ai (ACT) gee(VIC）作为检测靶点,鸡

47、肉检测是以allus gausrasforming gow factor bea-3(GFB3) ee(FAM）作为检测位点。检测流程:所有的用于验证检测方法灵敏度和特异性的样品按照酚氯仿方法抽提DA,通过蛋白酶K消化后处理得到NA。直接进行dP检测。检测结果：最终得到dP结果得到的拷贝数浓度建立的DNA拷贝数DNA质量标准曲线和DNA质量/食品干重标准曲线两条曲线,以这两条标准曲线代入样品dPR结果得到的两种基因拷贝数计算食品中不同成分的质量和比例。B-Rd解决方案：X20微滴式数字PR系统以其无与伦比的准确性和精确性为日常的核酸定量工作提供了极大的关心。真正的绝对定量,无需外参标准品及标准

48、曲线，数据重复性更好更高的准确性，不再依靠CR效率,抑制剂耐受度高,模板适用度广更高的分辨率，可识不倍浓度差异,适合GMO等类型实验更高的灵敏度,最低可检测到1个opy的argeReferee 1 Baln N Z,ogesen F K, Karsson A H.Speceeminaon - Cwe detect andquantify meat adulterai？J. Mea Science, 2，83(2)：165-176、转基因成分定性、定量检测检测背景随着转基因作物的全球性栽培和商业化进程的不断推进，越来越多的转基因食品、食品配料和添加剂等进入市场和餐桌，而转基因产品的食用安全、环境

49、安全风险及伦理等问题越来越受到社会的关注和重视。截至204年，全球28个国家的180万农民种植了1.81亿公顷的转基因作物。全球60多个国家和地区制定了相关的法律和法规，要求对转基因生物及其产品(包括食品和饲料)进行标识治理。Fig.1 GlobalMap ofBiotechCrp Countries and g-Countres 01目前，国际上关于转基因标识治理要紧分为4类:一是自愿标识，如美国、加拿大、阿根廷等；二是定量全面强制标识，即对所有产品只要其转基因成分含量超过阈值就必须标识，如欧盟规定转基因成分超过09%、巴西规定转基因成分超过1%必须标识;三是定量部分强制性标识，即对特定类不

50、产品只要其转基因成分含量超过阈值就必须标识,如日本规定对豆腐、玉米小食品、纳豆等24种由大豆或玉米制成的食品进行转基因标识,设定阈值为5%；四是定性按目录强制标识,即凡是列入目录的产品,只要含有转基因成分或者是由转基因作物加工而成的，必须标识。目前，我国是唯一采纳定性按目录强制标识方法的国家,也是对转基因产品标识最多的国家。截至201年,我国差不多批准5个转基因作物事件,包括批准商业化种植的转基因棉花、玉米、大豆,油菜等。关于这些转基因作物及其产品的安全评价，转基因成分的检测是转基因生物安全评价及标识治理的关键环节。我国已组建了国家农业转基因生物安全委员会、全国农业转基因生物安全治理标准化技术

51、委员会等机构公布转基因生物安全标准,并认定了40多个国家级的农业转基因生物监督检验测试机构，承担农业部或申请人托付的农业转基因生物定性定量检测、鉴定和验证实验工作。转基因成分的检测方法是对转基因食品进行确定、生产和治理的必要手段,需要准确有效的检测技术得以实现。转基因作物的特点确实是在其宿主基因组中导入一段外源NA序列，这段序列进行翻译而表达出新的蛋白质,从而使宿主获得新的性状，如对某些昆虫的抗性或对除草剂的耐性。因此，转基因作物及其产品中的转基因成分的检测,实质确实是检测转基因产品中是否存在外源DN序列或重组蛋白质产物。由于转基因产品的特征是含有外源基因和表现出导入基因的性状,因此，目前对转

52、基因产品的检测采纳的技术路线有两条，检测外源NA序列或检测外源基因的表达产物蛋白质。对外源基因表达产物蛋白质常用的检测方法有酶联免疫吸附测定法(Ezy-LemunoSrbet Asa,EISA）、蛋白质印迹法（WesterBlt）等;对外源DN序列的检测要紧是基于聚合酶链反应(PomeaseChn Rection,C)的方法，如定性PCR、实时荧光CR法以及数字PR方法等。这些方法不仅能确定样品中是否存在转基因物质，还能够通过对一系列的标准物质的检测构建标准曲线,对转基因成分的含量提供相对定量或绝对定量的检测结果。Fig.2 EvltonofGMO etectin mthds an assci

53、atdreerce mil1999年,Vaitilngom等首次利用实时荧光PCR技术对转基因食品中的转基因成分进行了定量检测，目前实时荧光PCR方法差不多成为食品中转基因成分的定量检测最常用的方法。实时荧光PC是一种通过标准物质制备的标准曲线对未知样品进行定量分析的方法,该技术能够对转基因成分进行定量分析，同时还具有灵敏度高、特异性和可靠性强、实时性和准确性高等特点。实时荧光PC方法要实现D的定量分析，需要一系列标准物质分不构建参照基因和目标外源基因的标准曲线,并最终通过计算外源基因序列与参照基因序列的量的比值实现对转基因成分的定量检测。然而,该方法由于阻碍因素较多，如标准物质和样品的背景不

54、同、不同基因扩增效率的不同、标准曲线的线性范围（分析样品必须落在标准曲线的上下限范围内)、低拷贝DNA扩增的重复性差等，均会造成定量结果的准确性差;而且，目前转基因品系的有效标准物质难以得到制备和标准化,将导致大量的转基因品系无法通过该方法进行定量检测。数字 PCR(gal PCR）是近年来在实时荧光 C 基础上进展起来的新一代DNA定量检测技术。PR 是将 PCR 体系分配到大量的小的独立反应单元中，实现微反应单元的单个DA分子的 PCR 扩增,结合荧光的终点检测及泊松分布原理、依照阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标N的拷贝数,实现绝对定量。dPCR方法降低了标准曲线及扩增效率对检测结果的阻

55、碍，摆脱了对标准物质的依靠，即可实现对A分子的绝对定量;同时提高了低拷贝DNA扩增的重复性和准确性。相比实时荧光PC,dPC具有更高的检测灵敏度、精确性和重复性,同时无需标准物质,是转基因成分定量检测的新方法。ig. 数字PCR的差不多原理转基因成分检测的技术平台及检测流程定性PCR法聚合酶链式反应（Pymease ch reaction，PCR）又称为PCR技术,是一种体外酶促合成特异DNA片段的方法。通过聚合酶的作用,在体外快速特异的扩增目的序列,使微量、特定的目的基因片段在短期内呈数量级的复制,扩增产物可通过琼脂糖电泳和染色后再凝胶成像系统中直接观看。通过对外源基因序列的特异性扩增检测,

56、定性PCR在转基因成分检测领域得到了广泛的应用,是一种快速、灵敏的核酸检测方法。该方法常常利用检测转基因操作的通用序列（如3S启动子、OS终止子等）或导入的外源基因的特异性序列来进行转基因成分的检测,因此用该方法需要依照标准设计序列特异性的引物对。要紧检测流程为:1）样本制备；）DN抽提;）PR扩增及电泳;4）成像及结果分析；5）结果及推断。美国伯乐(Bio-Rd）公司作为生命科学领域的领先者，一直致力为众多科学家解决实际科研应用问题，提供全套检测平台。C1000Touh PR仪性能优良,彩色大触摸屏便于轻松编程,适用所有CR反应;io-Ra提供完整系列的电泳仪,轻便、编程简单，并经最严格的国

57、际安全标准IEC001认证,是人员与环境的最高安全保证;全能型成像分析系统ChemiDoc能够进行一般成像、化学发光成像、多通道荧光成像，同时提供出色的灵敏度和广泛的适应性,是一个高端实验室的明智之选。定性PR的方法具有操作简单、快速，灵敏度较高，无需专门的仪器设备（仅需一般PCR及凝胶电泳、成像系统）,实验成本较低等特点,且该方法能够通过成像后目的基因的有无推断转基因成分的有无，实现转基因成分的定性检测。实时荧光定量PCR技术实时荧光CR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用R扩增期间荧光信号的累积、通过连续监测荧光信号强弱的变化来对目的基因进行定量分析的方法,已被广泛地应用于分子生物学研

58、究的各个领域。依照所使用的荧光信号来源的不同，实时荧光PR技术要紧分为基于SR Green I的染料法和基于序列特异性荧光探针的探针法。实时荧光CR技术需要标准物质构建标准曲线来实现对样品的定量分析检测。在转基因成分检测领域,标准物质通常是指一种含有转基因检测目的外源基因序列的重组质粒分子，在定性检测中作为阳性对比,在定量检测中用于标准曲线的构建，是相对定量和绝对定量检测转基因成分含量的基础。目前构建的标准物质要紧集中在比较重要的、世界范围内种植比较广的玉米、大豆和棉花转基因品系，其他还有许多转基因品系的标准物质还难以得到，还需要进一步的完善相关的测试和标准化鉴定。除此之外，标准物质和样品不同

59、的背景来源、参照基因与目的基因的扩增效率的差异，以及低拷贝外源基因的检测灵敏度等因素差不多上制约实时荧光PCR技术在转基因成分定量检测应用的阻碍因素。尽管如此,实时荧光PCR技术仍是目前最为常用的转基因成分定量检测方法。Fi. 实时荧光PCR法定量检测原理实时荧光PCR定量检测转基因成分的操作流程要紧为:样本制备、D提取、实时荧光PCR预备及扩增、结果分析及检测报告。具体如下：实时荧光PCR技术检测流程示意图实时荧光PC技术具有操作简单快速、灵敏度较高、特异性好等特点,建立实时荧光C技术平台对转基因成分的定量检测，需要荧光定量PC仪及配套的荧光PC反应试剂耗材。BoRa公司X6 Tuch六通道

60、的实时PR系统包括了先进的光学系统和精确的温控系统,安装简单且无需校准,可提供高灵敏、可信赖的检测结果，在转基因的定量检测领域已有广泛的应用。Bio-Rad FX6 toch数字PR技术数字R技术是指将加入了荧光基因的 PR 反应体系分配到大量的、小的独立反应单元中,实现微反应单元的单个NA分子的 PCR 扩增，结合荧光的终点检测及泊松分布原理、依照阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标A的拷贝数,实现A分子绝对定量的一种方法。dPCR技术已应用于基因表达差异研究、基因组学研究、医学检验、微生物检测及转基因食品或成分的检测等,在转基因成分的定量检测领域已有大量的应用文献的发表及支持。dPCR绝对定