吉玛公司RNAi设计原则

1、吉玛公司RNAi设计原则吉玛公司以国际上最先进的设计理念为依托，综合我们对RNAi文库筛选以及从客户反馈的结果，吉玛公司优先考虑的设计原则有以下几个方面：1. siRNA 设计原则1.siRNA双链末端的热稳定性，即 的值2.siRNA双链的反义链末端最后两个碱基的选择，即：20，21位置碱基的选择3.siRNA双链的反义链第1和第19位置的碱基的选择4.siRNA反义链的G+C的含量5.siRNA反义链的第2位和第18位置的碱基的选择6.siRNA反义链的第2位到17位局部稳定性的选择7.siRNA双链的正义链为基准，整个双链稳定性的分布为，5末端稳定性强，双链中间段，以断裂位点周围为例，稳

2、定性较弱，3段稳定性较弱注：正义链sense: 19碱基的靶点+TT悬头反义链antisense:21个碱基完全与靶点互补反义链最后两个碱基为脱氧核酸dNdN2.shRNA设计原则shRNA设计原则与siRNA设计原则相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相对于外源导入的siRNA在细胞内的有效浓度要低。shRNA末端设计以及双链的热稳定性是以DNA设计为基础，而siRNA是以mRNA为基础。1 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。

3、2 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。3 siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。4 在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。5 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。6 将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（/BLAST/）。由于没有完整的基因组序列，比对起来相对困难。

4、7 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。8 阴性对照:一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。9有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别，因为这个突出端无需和靶序列互补。合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列。siRNA寡聚核苷酸设计原则 siRNA的设计是决定RNAi实验成败关键性的第一步。并非每个siRNA都能有效引

5、发基因沉默。和引物设计一样，设计有效的siRNA也有一些经过前人经验总结出的规则，而且这些规则随着对siRNA研究的深入也在不断完善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高，3个保证中2个。 siRNA的反义链3端最好以UU结尾，这被公认是最有效的的siRNA结构。现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi，你可以尝试。不过如果是体外转录合成siRNA，要避免以G结尾，因为后继处理时RNase会切除末端的G。 多个siRNA位点最好分散分布在mRNA全长上。没有数据表明siRNA在mRNA上的前后位置和RNAi效果有什么特别的关系。如果siRNA位点因为mRNA

6、二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响siRNA效果，分散分布可以减少风险。不过，也有报道说，如果可能，最好能避开起始的50200个碱基，以避开潜在的调控蛋白结合位点。 避开和其他基因同源序列，以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里BLAST一下， HYPERLINK /BLAST /BLAST，和其他基因有16个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。GC比例30%-50%比高GC含量的siRNA的成功率要高些。有较多选择时留意，不要有连续9个以上的GC，也尽量避免出现连串的某个碱基。根据Schwards的文章，由于siRNA双链上只有一条链会结合RISC上，究竟哪条链取决于RNA解旋酶，而正义链5端以GC开头，且5端14个碱基GC含量高，且1619位碱基GC含量低的序列,得到的siRNA反义链5端GC含量低，3GC含量高（也有研究表明反义链5端前7个碱基至少有5个AU），使得反义链比较容易正确结合RISC，因而基因沉默效果比较好。 如果是shRNA表达载体，用的是RNA聚合酶III类的启动子如U6，最适合的结构是5GN，后面连续4个U结尾即可令转录终止，要避免序列中G，减出现连续的U/A。如果是自行设计siRNA的