实验体外重组

1、关于实验体外重组第一张，PPT共二十五页，创作于2022年6月实验目的与要求掌握体外DNA的重组过程；学习外源DNA分子经限制性内切酶切割后与载体的连接及转化过程；学习对DNA重组子的筛选方法。 第二张，PPT共二十五页，创作于2022年6月实验原理实验材料实验步骤预期结果注意事项第三张，PPT共二十五页，创作于2022年6月一、实验原理1、DNA重组简介2、DNA连接酶3、TA克隆4、蓝白筛选第四张，PPT共二十五页，创作于2022年6月DNA重组是外源DNA与载体分子的连接，重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将经过酶切的或脱磷酸处理的载体分子与

2、外源DNA分子进行连接。这样经过重新组合的DNA叫做重组体或重组子。1、DNA重组简介第五张，PPT共二十五页，创作于2022年6月DNA重组包括如下步骤： 外源DNA片段的制备； 载体的选择； DNA片段与载体连接； 导入宿主细胞。第六张，PPT共二十五页，创作于2022年6月第七张，PPT共二十五页，创作于2022年6月第八张，PPT共二十五页，创作于2022年6月 2种连接酶T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 （1）大肠杆菌DNA连接酶 仅能连接具有相同粘性末端的两个DNA分子。2、DNA连接酶第九张，PPT共二十五页，创作于2022年6月（2） T4噬菌体DNA连接酶 不仅

3、能连接具有相同粘性末端的两个DNA分子，还可以连接平末端双链DNA分子。 但后者连接效率比较低，一般可提高T酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。第十张，PPT共二十五页，创作于2022年6月2、DNA连接酶 T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步： 首先，T4连接酶与辅助因子AMP形成酶-AMP复合物； 然后，酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3-羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化； 最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。酶最适温度为37 ，但该温度下粘性末端氢键不稳定，所以连接反应一般采取1216 连接过夜。第十一张，PPT共二十五页，创作于2022年6月磷酸

4、二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接第十二张，PPT共二十五页，创作于2022年6月3、TA克隆将3端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3端具有单个“T”突出末端的线性化载体的克隆法。第十三张，PPT共二十五页，创作于2022年6月第十四张，PPT共二十五页，创作于2022年6月4、 蓝白筛选pUC质粒载体含有大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lac z）的启动子（受IPTG诱导）及其编码肽链（ -半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lac z基因）。位于 lac z基因中靠近5端有一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。第十五张，PP

5、T共二十五页，创作于2022年6月受体大肠杆菌细胞的-半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。当lacz基因编码的肽链同失去了正常氨基末端的-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的-半乳糖苷酶分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。第十六张，PPT共二十五页，创作于2022年6月当MCS中插入外源基因后，会阻断肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的-半乳糖苷酶，也就不会产生蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。第十七张，PPT共二十五页，创作于2022年6月二、实验材料l、仪器和材料 感受态细胞(如E. coli JMl09、DH5 a)恒温培养箱，恒温摇

6、床，恒温水浴槽，1.5 mL微量离心管（Ep管），微量取液器200 L及20 L吸头，电泳仪，电泳槽。第十八张，PPT共二十五页，创作于2022年6月 2、试剂 (1) 载体：质粒pUC l8/19 (2) 目的基因：如小牛胸腺DNA (3) 限制性内切酶：EcoRI，Hind (4) T4 DNA连接酶 (5) 0.1 mol/L CaCl2溶液 (6) LB琼脂固体平板 （含氨苄青霉素） (7) 5 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素） (8) 20 mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷） (9) 200 mg/mL IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷） (10)

7、 琼脂糖 (11) 无菌双蒸水第十九张，PPT共二十五页，创作于2022年6月三、实验步骤1、双酶切目的基因及载体（TA克隆法可省此步）2、连接与转化3、培养观察第二十张，PPT共二十五页，创作于2022年6月1、连接（5L 体系）：pEASY T3 1L PCR纯化产物 1-4L （Taq酶扩增）25 连接15min。一般，载体:外源基因（摩尔比）=1:21:102、转化：10L连接产物全用来转化200L大肠杆菌感受态细胞。在含Amp的LB平板上，添加40 L 20 mg/mL X-gal及4 L 200 mg/mL IPTG，然后涂布转化后的细胞。3、培养：37 ，倒置培养16h后，观察结

8、果。计数白色和蓝色菌落。第二十一张，PPT共二十五页，创作于2022年6月四、预期实验结果37倒置培养1216 h后，平板上可见生长有蓝色和白色的菌落，其中白色菌落含有重组DNA，蓝色菌落含有未重组成功的质粒DNA 第二十二张，PPT共二十五页，创作于2022年6月五、注意事项双酶切时，注意选择合适高效的2种酶，注意双酶的缓冲液、温度的协调。酶的加入量须小于反应体积的1/10，否则酶液中所含有甘油会抑制酶解反应。注意连接体系中，载体与插入片段之间的 摩尔比。插入片段所需量（ng）=载体含量（ng）*插入片段长度（kb）载体长度（kb）*片段与载体摩尔比第二十三张，PPT共二十五页，创作于2022年6月时间安排8: 3