细胞悬浮培养与次生代谢物质生产

1、 第六章 植物细胞悬浮培育及次生代谢产物消费 .1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上初次胜利地采用紫草细胞培育工业化消费紫草宁。.北京锦绣大地农业股份gldadi/index.html.1 植物次生代谢产物概述 2 细胞的初代培育 3 高产细胞系的挑选 4 植物细胞悬浮培育方法 5 植物次生代谢物质消费.1.1 植物代谢产物1初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必需的代谢。初生代谢过程中构成的各种产物为初生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。2次生代谢：建立在初生代谢根底上，对于植物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物，比较稳定

2、，可以在体内积累。. 类别 次生代谢产物 用途 黄酮 银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病 醌 紫草宁 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 简单酚类 香豆素 香料，抗菌消炎萜 类 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗疟疾生 物 碱 长春新碱 抗癌 奎宁 抗疟疾酚类化合物.长春碱： 2 million/kg长春新碱： 15million/kg. 李时珍在中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次消费物。天然的次生代谢产物曾经超越2万种。次生代谢产物的运用：色素、香料、药物、添加剂、工业原料等。.紫杉醇：二萜类化合物最早由太平洋红豆杉Taxus brevifoli

3、a的树皮中分别广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症目前主要来源于红豆杉属植物紫杉醇简介.市场需求抗癌一线用药销售额年增长率5亿美圆 实际需求量 2g /人, 500万人/年 1000kg/年实践销量350 kg/年紫杉醇供需相差非常悬殊 图1：国际紫杉醇原料药需求走势图单位：公斤图2：国际紫杉醇销售额亿美圆.药源问题红豆杉 主要原料植物 国家一级维护野生植物，全球十大濒危物种之一生长缓慢 分布有限 Taxol含量低 树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人700岁的红豆杉惨遭剥皮.人工栽培 采用种子繁衍、扦插等

4、无性繁衍方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗寻觅红豆衫的替代物 从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物药源问题处理方法一.药源问题处理方法二化学合成全合成 1994年获得胜利 现有六种途径半合成 以10-DAB和Baccatin 作为半合成原料获得紫杉醇.药源问题处理方法三生物方法组织和细胞培育微生物发酵生物合成 研讨阶段 红豆杉生物合成途径根本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量 .1.2 获得植物次生代谢产物的方法从植物中提取化学合成植物细胞大规模培育消费次生代谢产物植物细胞具有形状全能性，化学全能性在离体的条件下可以合成整株植物能合成的物质.

5、自然植物和细胞培育的紫草宁含量比较消费方式 消费周期 紫草宁含量干重完好植物 23年 12植物细胞培育 3周 14.细胞培育是消费次生代谢产物的理想途径：缩短周期，提高消费效率植物细胞培育消费周期为15-30d；而完好植株生长短那么几个月，长那么数年，如木瓜8个月，而紫草为5年易于管理，减轻劳动强度培育在无菌条件下进展，可排除病虫害干扰可探求新的合成道路，获得新的有用物质.1.3 植物细胞悬浮培育：即是将植物细胞或小的细胞团在液体培育基中进展大规模培育的技术。.胜利的悬浮细胞培育体系必需满足3个条件：分散性良好，细胞团较小，普通在 3050个细胞以下，在实践培育中很少有完全由单细胞组成的植物细

6、胞悬浮系。细胞分裂快，均一性好，细胞外形和细胞团大小大致一样，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培育基清澈透亮，细胞色泽呈艳丽的乳白或淡黄色。有效成分含量高。次消费物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率可控遗传要素决议. 植物细胞培育具有周期长、细胞抗剪切才干弱、易聚团等特点。 植物细胞培育反响器的设计不仅要思索有利于细胞生长，还要思索有利于产物的积累和分别。 适宜植物细胞培育的反响器应具有适宜的氧传送、良好的流动性和较低的剪切力。.2 细胞的初始培育实验中获得适宜于悬浮培育的细胞系的过程称为细胞的初始培育。2.1建立悬浮系获取悬浮培育的细胞细胞的振荡培育酶解法愈伤组织培育法使细胞团分散促进气体

7、交换.搅拌培育； 旋转振荡培育； 旋转培育培育方式：.2.2 建立良好的悬浮系的关键环节 1. 选择适宜的外植体双子叶植物：幼胚、成熟胚、下胚轴、叶片单子叶植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花药等. 2. 诱导疏松愈伤组织； 培育基 愈伤组织的异质性； 继代培育 3. 选择适宜的培育基； 根本培育基+CTK/AUX+天然复合物 eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE 培育基的PH.李忠光，龚明. 2006.7.4. 悬浮培育初期的控制 转速，光，温度5. 悬浮细胞的继代与选择 继代中搜集小的细胞团 条件培育基：新颖培育基.3 高产细胞系的挑选(P113)3.1高产细胞系 挑选的整体思绪外植体

8、愈伤组织的诱导挑选悬浮培育细胞高产细胞系挑选.高产细胞系的建立高产细胞株系的特点培育细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最好能将其释放到培育基中.高产细胞系的挑选过程选定特定起始资料准确选择可以产生目的代谢产物的植物种类、种类或单株应尽量选择自然形状下产生天然产物的组织或器官为外植体诱导愈伤组织，并获得单细胞悬浮液诱变处置细胞悬浮液，挑选目的突变细胞经过单细胞培育突变细胞，获得突变细胞无性系即突变细胞愈伤组织获得.高产细胞系的挑选方法目测法留意：真正的变异体or生理形状不同的细胞克隆

9、根据单细胞克隆次生代谢产物含量进展挑选抗性挑选如：添加抗性抑制剂 庚二酸-生物素诱变挑选.3.2 高产系的稳定性及保管方法尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保管法0-4，超低温保管法-196 保管。同时从高产系中不断克隆构成新的高产细胞系。.4 植物细胞悬浮培育的方法悬浮培育：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液体培育基中，不断搅拌或者振荡培育，使细胞快速、大量增殖。技术难点：通气、剪切力的顺应性；细胞同步化控制。培育：培育基：根本培育基+CTK/AUX 培育条件：温度、氧气、PH、转速同步化控制细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。.4.1 细胞悬浮培育的方法(P117

10、) 分批培育法 延续培育法 半延续培育法 细胞固定化培育.分批培育：把细胞分散在一定溶积的培育基中进展培育。注：中途不添加也不改换培育基设备简单，操作方便，反复性好。适宜与突变体挑选和遗传转化的研讨。.悬浮培育细胞增殖曲线 时间d细胞数量123451滞后期、 2对数生长期3直线生长期 、4减缓期5静止期1细胞扩增生长成S形曲线2继代培育：要求缩短滞后期 滞后期的长短：a 继代细胞所处的生长时期；对数期 b 继代的细胞密度 104-105个/ml.延续培育：在培育过程中，不断向反响 器中以一定流量添加新培育基，同时以 一定流量从系统中取出培育基及培育物的方式。参与培育基排出培育基及其培育物.半延

11、续培育：在完成分批培育的一个周期 后，从反响器中取出大部分细胞悬液，只 保管小部分细胞悬液作为下一培育周期的 种子细胞，然后参与新颖培育基进展培育 的方式。细胞固定化培育：将细胞固定在固相基质上，放入培育液进展培育的方式。.悬浮培育反响器的类型： 机械搅拌式反响器 气动式反响器内循环气升式外循环气升式.机械搅拌式.内循环气升式.外循环气升式.4.2 培育基：与培育的细胞密度相关1高密度悬浮系5*104个/mla 用B5，ER等公用培育基b 对传统培育基做出改良如：加大2,4-D用量；改良MS，参与VB、CH等天然复合物2低密度悬浮系5*104个/mla 条件培育基b 向培育基中添加多种成分，尽

12、能够满足细胞生长的需求.细胞同步化：同一悬浮培育体系的大多数细胞都同时经过细胞周期的某一特定时期。细胞培育的同步化方法：饥饿法：限制必需物质的供应抑制法：化学抑制，物理抑制分级培育：细胞分级仪4.3 悬浮细胞培育的同步化(P121).4.4 悬浮细胞的生长量和活力分析(P122)1测定悬浮细胞数量的方法：细胞计数-血球计数板 鲜重、干重的测定细胞密实体积(PVC)2细胞活力测定二乙酸荧光素法 FDA-活细胞内有荧光产生伊凡兰染色法-染色受损细胞核-死细胞相差显微镜法-胞质环流能否存在. 5 植物细胞大规模培育消费次生代谢物质植物细胞大规模培育的技术要求： 从工程的角度讲必需求进一步研讨和开发适

13、宜于植物细胞生长和次生代谢产物消费的生物反响器，建立最正确的控制和调理系统。 从细胞生长与培育技术方面讲必需满足以下3个条件： 1、培育的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。 2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。 3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培育基中。.5.1 技术道路 (1) 选择适宜的外植体；诱导疏松愈伤组织； (2) 经过含量分析，选择高产细胞系 (3) 研讨培育条件到达高产、稳产； (4) 建立悬浮细胞培育、优化培育条件 到达高产、稳产； (5) 小试、中试、优化培育条件； (6) 大规模培育； (7) 工业化消

14、费，产品分别，纯化。 .5.2 提高次生代谢产物产量的方法1挑选高产细胞系 不同植物种类，不同植株及同一植株的不同部位，往往有不同的代谢才干； 经过人工诱变改良细胞系； 经过遗传改良挑选细胞系。 .云南红豆杉东北红豆杉中国红豆杉南方红豆杉杂种红豆杉. 挑选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需求定期检测，更新细胞株系。.培育基的营养成分一方面要满足植物细胞的生物量增长，另一方面要使细胞能合成和积累次消费物。故在生长的第一阶段运用生长培育基；第二阶段运用消费培育基普通来说添加培育基的N、P和K浓度能促进细胞生长，而适当添加糖浓度那么有利于次消费物的合成；而激素需根据实验确定适于植物细胞悬浮培育的根底培育基主要是B5和ER 2优化培育基 根本培育基+激素+天然复合物 . 3改善培育条件 对于任何一种细胞培育，培育条件都要经过多次的实验探求确定。 eg: 在胡萝卜愈伤组织培育中，光照条件使紫红色愈伤组织可以生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。 .4培育基中添加前体物质在细胞内次生代谢物质是以初生代谢物质为原料，经过一系列的化学转化而合成的，