使用对pH敏感的聚

1、内容可在SciVerse ScienceDirect 列表中查询BiomaterialsBiomaterials期刊首页：w ww.elsevi /locate/biomaterial s使用对pH敏感的聚(乙二醇)-聚-L-组氨酸的水凝胶控制二型重组腺相关病毒的释放Yi-Fang Zenga,1, S.-Ja Tseng b，1, Ivan M. Kempson b, Shu-Fen Peng c，d，e, Wen-Teng Wuf, Je-Ruei Liu a，g,h,*a Institute of Biotechnology, National Taiwan University, Ta

2、ipei 106, Taiwanb Institute of Physics, Academia Sinica, Taipei 115, Taiwanc Department of Biological Science and Technology, China Medical University, Taichung 404, Taiwand Department of Medical Research, Children s Hospital, China Medical University Hospital, Taichung 404, Taiwane Department of Pe

3、diatrics, Children s Hospital, China Medical University Hospital, Taichung 404, Taiwanf Department of Chemical Engineering, National Cheng Kung University, Tainan 701, Taiwang Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University, Taipei 106, Taiwanh Agricultural Biotechnology Rese

4、arch Center, Academia Sinica,Taipei 115, Taiwan文章信息文章简介文章信息：2012年8月28日揽收2012年9月11日通过2012年9月29日上线关键字:聚（乙二醇）-聚-L-组氨酸二型重组腺局部基因传递pH值敏感伤口处理以合成聚合物为载体装载病毒的方法，在病毒基因传递相关领域是一个很有 前景的方向。在特定的场合中通过水凝胶来传递基因表达是一种多用途的方式。 在这项研究中，将含有绿色荧光蛋白基因（ rAAV2-GFP）的腺相关病毒血清 2型 装入聚（乙二醇）（PEG）水凝胶，通过掺入或者不掺入聚-L-组氨酸肽来进行论证。生理范围中由聚组氨酸肽组成p

5、H敏感的水凝胶，包含损坏的血管结构系统、细胞吞噬系统。聚组氨酸肽用于控制膨胀、吸水率和后续发生的水凝胶降解程度 以及rAAV2-GFP的释放速率。所述PEG-组氨酸肽水凝胶的溶胀率与环境pH值的增加呈反比。随着 pH值从7.4下降到6.0，PEG-组氨酸肽水凝胶溶胀率和降解 率分别提高875 %和135 %。结果显示，在人体 HT-1080纤维肉瘤细胞中的 PEG- 组氨酸肽释放的rAVV2-GFP的释放和传递效率与PEG水凝胶相比显著提升。传递速度可以通过水凝胶的组氨酸肽浓度进行控制，并且在局部发生炎症的范围里降 低了对pH值的敏感度。这涉及到目前最先进的伤口护理与再生医学的应用。 2012

6、 Elsevier Ltd.保留所有权利 .1.前言非病毒载体由于免疫原性较低在基因传递领域中广泛应用， 它的能力可适应和提供大尺寸遗传物质，并且存在有关生物相 互作用的表面物理评估和化学性质改性的潜力1 e 4。然而，非病毒的基因表达载体的相对低的效率，相较于病毒载体，降低 了基因传递的效率。但重组腺相关病毒（腺相关病毒）作为备 选选择是用于递送遗传分子有力的转基因载体。腺相关病毒的 优点包括相对容易地产生高滴度、高效率转染分裂和非分裂细 胞的能力、大基因组传递的稳定性，低水平的病毒基因组整合 度以及广泛的病毒生物学特性的能力 5。* 作者通讯地址：Institute of Biotechn

7、ology, National Taiwan University,4F,No. 81, Chang-Xing St., Taipei 106, Taiwan. Tel.:+ 886 2 3366 601 1; fax: + 886 23366 6001.电子邮编： HYPERLINK mailto:jrliu.tw jrliu.tw （J.-R. Liu）.1文章第一、二作者（Y.F. Zeng and S.J. Tseng） 对本文有相同贡献 .0142-9612/$ e see front matter 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved. HY

8、PERLINK /10.1016/j.biomaterials.2012.09.018 /10.1016/j.biomaterials.2012.09.018在人类临床试验中，腺相关病毒携带特定基因材料进行基 因治疗已显示出可喜的成果6,7。然而，非特异性和更有疗效的基因表达内容不足仍是亟待解决的问题。传递的基因远离的 目标位置可能会导致一种或者多种不良结果：如损失效率、基 因表达异位或会有很高的风险引发严重的免疫反应。最近一些研究已经表明，随着生物材料基质与病毒载体的结 合，通过支架结构固定或封装到一个基质的表面可以提高基因 表达。8e 11。报告证实使用复合再生医学工程与病毒基因治疗 技术

9、结合，在治疗皮肤创伤及骨移植是有前景的方向。12 e 14.此外，病毒载体与生物材料层层叠加可以达到调节病毒嗜性或 降低炎症和免疫反应的目的15e17。聚合物涂层的载体的表面可以通过循环动力学提高在血浆中 的流动程度，接触被动的或官能化的体内目标。然而，聚合物 涂覆的载体的一个主要相关的作用是非特异性结合并通过内吞 作用进入非靶细胞，特别是可以通过表面正电荷进行促进这种 效应的发生。因此，生物相容基质为可控制的、长期的、并且 可以局部传递。一种方法是在一个特定的环境下触动释放病毒 的机制。利用伤口部位的生理特性，用于受控药物递送的pH依赖型输送系统已经在多个例证中出现4,18e22。聚（乙二醇

10、）（PEG）基水凝胶已经表明已被广泛用于组织再生医学及在多个例证中的药物递送23e27。PEG在很大程度上是由亲水部分是无免疫原性及抗蛋白质吸附的部分组成27,28。因此，PEG水凝胶经常被认为是可以模仿非生物污损特性和天然 的细胞外基质的功能而存在。PEG水凝胶的稳定性和降解速率可以通过调节其固含量来控制；并且还可以优化控制药物和基因 的传递特性23 e27。由于在微酸性的生理pH值范围内构成正电荷的属性，对于药物或基因递送的目的，组氨酸被频繁作为传递工具。 18,19,21。另外，通过组氨酸的胺基团的质子化可调节基质的 表面Zeta电位，促进水的吸收18,19,21。因此，在本研究中，我们

11、力图通过将各种浓度的多聚组氨酸的 插入PEG水凝胶中来合成对 pH敏感的水凝胶。组氨酸的咪唑环的氨基的离子化是由pH值所控制的，其 pKa值定义为 6.10，被称为生物性酸中毒。为在吞噬损坏的血管的 过程中释放了酶，受伤/受损组织的生理环境被证明更加酸性（pH值5.5）或更低29。当这些组织生长或自我修复完成后， 损伤部位的pH值将会恢复到正常的生理范围。在本所述中，我 们促进特定蛋白质的高效表达的方法是通过病毒介导的酸性范 围内的遗传操作。我们利用包括基于PEG的水凝胶 pH敏感部分来传授对pH值的响应，这样我们将达到预期的对局部的pH引发病毒释放有益的物理化学机制。在方案1中将会展示出合成

12、了参入多组氨酸（聚氨酸）的 PEG水凝胶，它是可 生物降解且对 pH敏感的一种水凝胶。我们还在中性和弱酸性 的环境条件下，对红肿生理环境状态的水凝胶的稳定性/降解进行了测定。此外，还将含有绿色荧光蛋白基因（AAV2-GFP）的rAAV2作为对照组装入所述 PEG聚组氨酸水凝胶。 根据在不同pH条件下HT-1080细胞释放的rAAV2-GFP的传递效 率确认来环境介导的释放。 rAAV2-GFPUVPoly(ethylene glycol) (PEG) diacrylate0.05% (w/v) photoinitiator10% (w/v) poly-L-lysine (polyLys)w;

13、w/o Poly-L-histidine (polyHis)PEG-polyHis Hydrogel方案1的pH敏感水凝胶的实验方法示意如图：rAAV2-GFP被嵌入到PEG或PEG聚组氨酸水凝胶和在中性（ pH值为7.4）或酸性（pH6.0）的环境下培养。在酸性条件下，多聚组氨酸的胺基是大部分质子化的，从而导致由PEG聚组氨酸水凝胶增强了对水分的吸收。2.材料和方法化学试剂聚乙二醇二丙烯酸酯（Mn % 700g/mol ）氘代二甲基亚砜（DMSO-D 6 ）2-羟基-40- （ 2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮 聚-L-组氨酸盐酸盐（聚氨酸，分子量Mw%5000 Da ）聚-L-赖氨酸溶液（

14、聚赖氨酸，分子量 70,000e 150,000 Da ）和磷酸 盐缓冲盐水（PBS , pH7.4 ）分别从 SigmaeAldrich 有限公司（圣路易斯，密苏里州）购得。rAAV2-GFP 病毒（浓度：1 X 1012的基因组副本（GC） /毫升），从细胞生物实验室（加利福尼亚州圣迭戈）购买。 CellTiter96水性单溶液细胞增殖测定试剂盒3- （ 4,5 -二甲基毗啶-2 -基）-5- （ 3 -羧基甲氧基苯基）-2 - （ 4 -磺苯基）-2H-四唑金翁（MTS ）的测定是从 Promega （麦迪逊，威斯康 星州）购得。PEG和PEG-聚组氨酸水凝胶的合成对于PEG水凝胶的制备

15、，通过将聚乙二醇二丙烯酸酯溶解 在含光引发剂的去离子水和聚赖氨酸中来制备的PEG前驱体溶液（2-羟基-4 - （ 2-羟乙氧基）-2-甲基苯基丙酮），在 PEG 终浓度为 0.02% （ w / v ）、0.05% （ W / V ）的光引发剂和 10% （W / V ） polylys（聚赖氨酸）中。PEG的前体溶液，放在透明的 圆柱形容器（10毫米直径，5毫米高）暴露于 8-20 mW/cm2 的 365纳米的紫外光下10分钟以便于光聚合反应。光聚合后，直到进一步的分析，形成的 PEG水凝胶在去离子水。对于PEG-聚组氨酸水凝胶的制备，polyHis （多聚组氨酸）与含有光引发剂的去离子水

16、溶液和polylys （聚赖氨酸）搅拌溶解，在终浓度为0.05% （ w / v ）的光引发剂、 10% （ W / V ）polylys（聚赖氨酸）和 1、2、5、10、或 20% （ W / V ） polyHis（多聚组氨酸）。聚乙二醇二丙烯酸酯被溶解在浓度为 0.02% （ w / v ）的混合溶液中制备PEG-polyHis 前驱体溶液。最后，PEG-polyHis前驱体溶液放置在透明的圆柱形容器（10毫米直径，5毫米高）暴露于 8-20 mW/cm2的365纳米的紫外光下 10分钟以便于PEG-polyHis水凝胶的形成。凝胶特性PEG和PEG-polyHis 水凝胶通过用1H核磁

17、共振（NMR）谱来测定（瓦里安 Unity INOVA 500兆赫光谱仪，瓦里安公司，帕洛阿尔托，CA，USA ）。纯 DMSO-d6 溶剂（99.8% ）作为参考。 峰与所提出的结构的 PEG水凝胶的一致如下：1H NMR （500 MHz, DMSO-d6, ppm） d: 2.4e2.6 （eOeC（O）eCH2CH2e）, 3.7, （eOCH2CH2e）. 为了确定的水凝胶的平衡溶胀比，PEG和PEG-polyHis 水凝胶聚合后立即在真空烘箱中干燥24小时，称重可获得初始干重的（Wi ）。然后，水凝胶被允许在 37摄氏度50毫升的PBS 液膨胀（pH 6或7.4 ）来得到不同的潜伏

18、期。在潜伏期，水凝 胶每天被转移到一个新的PBS溶液，他们的溶胀重量（WS）在实验结束时测定。计算 WS /WI的水凝胶的溶胀率。为了确定降解率，PEG和PEG-polyHis 水凝胶的初始干重 （Wi ）可以通过上述过程在光聚合后立即测定。然后，将干凝 胶在37摄氏度50毫升的PBS溶液孵育（pH为7.4或6） 10周。 在潜伏期，水凝胶每天被转移到一个新的PBS溶液中。该水凝胶用PBS溶液洗涤，每星期通过真空干燥和称重可以得到干重 值（WD ）。水凝胶的重量损失（%）的计算：（Wi-Wd）/Wi*100聚乙二醇和聚乙二醇聚组氨酸水凝胶的细胞毒性人类 HT-1080 纤维肉瘤细胞（ATCC

19、CCL-121）保持在 Dulbecco 改良的 Eagle氏最低基本培养基中 （DMEM, Invitrogen, Carlsbad,CA），添加 10%胎牛血清（FBS ）， 100U/ml 青霉素，和 100mg/ml链霉素在37度和大气中二氧化碳含量为百分之五的情 况下。大约105的HT-1080细胞接种在完整的24孔板培养每个孔中。然后将细胞暴露于PEG或pegpolyhis水凝胶并孵育 24小时。通过MTS以CellTiter - 96 的测定方法测定细胞增殖测定试 剂盒在490nm对活细胞影响进行了监测， MTS以细胞没有水凝胶 （对照组）在 pH 7.4被设定为100%并减少M

20、TS经水凝胶的细胞 达到规范化控制。实验数据显示三种结果是标准偏差。从水凝胶的pH依赖性释放基因 GFP对于制备rAAV2-GFP-嵌入式PEG和PEG-聚组氨酸的水凝胶， 使用含水rAAV2-GFP 溶液（5毫升，1 X 109毫升的GC-1 ）与PEG 或PEG-聚组氨酸的前体溶液并混合的水凝胶由光聚合来进行制备。 大约105个HT-1080细胞接种在 24孔板的每个孔中，并保持在 37 C，pH 7.4的环境中12小时。每天在实验期间，需要更换在 每个孔中的培养液和新鲜的培养基。用0.4毫米的孔径大小的多孔聚酯Transwell （康宁，纽约州）插入件被放置在24孔板的每个孔中。然后将一

21、块rAAV2-GFP-嵌入了 PEG或PEG-聚组氨酸的水凝胶，在 37 C，pH为6.0或7.4的环境下置于Transwell 中，插入并孵育在完全 DMEM状态（0.5毫升），保持10周。在发病潜伏期间，在完全 DMEM下插入Transwell 的pH值 每天都调整。自由形式rAAV2-GFP转导而对非转导的细胞作为阳性对照。从每个实验组的HT-1080细胞每周收集和GFP的表达水平进行了测定，本实验使用了定量实时逆转录PCR （定量RT-PCR） ， andfluorescence 显微镜等仪器以评估 rAAV2-GFP的转染 效率从水凝胶在不同pH条件下释放。转基因表达分析将表达GFP

22、的细胞的荧光强度分别使用BD的FACSCalibur流式细胞仪系统（BD Biosciences公司，圣地亚哥，美国，加州），用488nm的氩激光和530 nm的发射过滤器测定。流式细胞 仪使用前向散射（FSC ）与侧向散射（SSC ）散点图排除细胞碎片 门控，并为每个分析获得10,000个事件。4,30.所有这些细胞的所有的RNA都是从 RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN公司，美国加州）提取，第一链 cDNA的合成是使用 Superscript III 反转录酶 工具箱（Invitrogen 公司，美国加 州），具体步骤参照各公司产品的操作手册。qRT-PCR的定量使用了

23、一台 ABI-7900HT 实时 PCR 机（Applied Biosystems 公司，美国加州）。所有反应均在一式三份20mL的反应体积中进行。PCR扩增在包括初始变性步骤在95 C /10分钟，PCR检测在95 C /15 秒和 60 C /60 秒的 40个循环中。 TCCTTGAAGAAGATGGTGCG-30-使用下列的正向引物：50-AAGTT- CATCTGCACCACCG-30和反向引物 50的GFP编码序列进行扩增。数据显示为平均值土为一式三份进行实验的标准偏差。 在对统计显着性检验，采用双尾t检验计算的P值，异方差假设。对HT-1080细胞的细胞核用碘化丙锭（ PI，分子

24、探针，俄勒 冈州尤金，美国）进行染色 进行荧光显微镜观察。使 用 Olympus IX-70 倒置荧光显微镜（Olympus 公司，东京，日本） 用氩激光器（488 nm ）的源激励时，采用 505e525纳米过滤器 的GFP发射和560e600纳米过滤器的PI发射进行分析。结论和讨论因此，对pH敏感的水凝胶可以用作矩阵病毒的封装。然后调节成分可以进行更多的具体的局部基因传递。PEG-聚组氨酸水凝胶的溶胀特性亲水性基质，如我们的PEG-聚组氨酸这里所描述的水凝胶，将通过肿胀控制机制释放药物和病毒的有效载荷，其中溶剂分子与聚合物基质的后续肿胀程度向内的磁通来控制药物的释放32。增大可使用的聚合物

25、基质的溶胀率，以增加药物的释放速率。由于水凝胶的溶胀行为的物理化学性能，我们测定聚组氨酸浓度对PEG-聚组氨酸的水凝胶的溶胀率存在影响。浸没在pH 6.0或7.4的环境下进行一周的培养后，将对PEG-聚组氨酸的水凝胶的溶胀率进行测定。达到平台期再培养一周后，该状态下潜伏期的水凝胶的溶胀率保持不变（数据未显示）。此外，PEG-聚组氨酸水凝胶的pH为7.4的溶胀率不随掺入多聚组氨酸的浓度变化（图1）。然而，随着分别掺入0-20%的聚组氨酸，在PH6.0时的溶胀率从24.6增加到120.0。这意味着酸性条件下，由水凝胶发生肿胀来增加对水的吸收27,33。对pH敏感的水凝胶具有应对环境变化，并通过 p

26、H敏感的释放机制释放药物的能力32。这些水凝胶是由含有可电离的官能团的网络组成的。在含有阴离子基团，如羧酸或磺酸的水凝胶中，当环境的pH值高于该侧基的 pKa就会发生电离。游离增加固定电荷的数目，从而提高了静电排斥在网络中的链之间，从而增加亲水性和水凝胶的溶胀比。反之，阳离子水凝胶含有侧基如胺，在下面的侧基的pKa的pH环境中被离子化。因此，在低pH值环境中，电离增加而引起的静电排斥的增加，导致增加的亲水性和水凝胶的溶胀比32。在这项研究中，聚组氨酸（ pKa值=6.10）被纳入PEG水凝胶。因此，酸性 pH值条件下，多聚组氨酸的胺基大部分是质子化的，从而导致由水凝胶增加水分吸收。这反过来又导

27、致在PEG-聚组氨酸水凝胶的溶胀较大比例。从PEG-聚组氨酸水凝胶释放的rAAV2-GFP通过酸化培养基评估病毒释放的PEG-多聚组氨酸的水凝胶，rAAV2-GFP被嵌入到PEG水凝胶和PEG-多聚组氨酸的具有不同组氨酸的水凝胶中。水凝胶嵌入rAAV2-GFP 在pH6.0或7.4的环境中24小时，将细胞的绿色荧光强度通过流式细胞仪检测分析共培养用HT-1080细胞。该结果表明，当细胞共培养以引入不同比例聚组氨酸的pH为7.4 （图2）的水凝胶中，转导效率差异是不明显的，这表明PEG-聚组氨酸的水凝胶在中性pH值对病毒转导效率没有影响。然而在细胞共培养在 pH值为6.0时，转导效率逐渐与PEG

28、聚组氨酸水凝胶中聚组氨酸呈正比率增加。同时GFP的表达情况以一个有效的线性方式增加，它与肿胀程度相关。我们建议的高转导效率的PEG-聚组氨酸在 pH为6.0的环境下比水凝胶吸收更多的水是归因于PEG-聚组氨酸的水凝胶比PEG水凝胶以更大的速率释放rAAV2-GFP。因此，从PEG聚组氨酸水凝胶 rAAV2-GFP 的释放速率可通过控制掺入聚组氨酸 的程度来控制。水凝胶通常用作组织工程支架，药物递送载体，或用于局部基因递送病毒载体的载体10,23 e27.在临床应用中水凝胶已经被应用以促进组织的形成，或诱导转基因的表达式在各种方向对于生理改善组织再生的应用中34,35.在这些情况下，生理环境由于

29、在炎症细胞吞噬功能中受损的血管和（或）活化的酶变得更加偏向酸性环境（pH5.5）29。250o20o一 W 6u=qms0050(-0.4U0。oMwod0CD5a5c8(l)d)Aaua)oira)u.21JnpsuEJ.0001251020Incorporation of polyHis ratio(%, w/v)251020Incorporation of polyHis ratio(%, w/v)（图1：在不同pH值的PBS溶液中聚组氨酸上的PEG的溶胀比的掺入浓度对水凝胶的影响：PEG聚组氨酸水凝胶溶胀的程度依赖于在酸性条件下的多聚组氨酸的浓度。可见在pH 7.4的环境下并没有区别。

30、这些水凝胶均达到平台期培养1周后的溶胀率水平。该柱状图代表平均值土标准偏差（ n = 3）。）（图2 :多聚组氨酸对AAV2-GFP嵌入水凝胶的转染效率的结合浓度的影响。该嵌入rAAV2-GFP的PEG或PEG多聚组氨酸的水凝胶培养在 pH 7.4或6.0环境下，并用共培养 HT-1080细 胞10周时，将这些水凝胶和细胞插入多孔聚酯Transwell 分隔（孔径 0.4毫米）。绿色荧光蛋白的表达细胞荧光强度由流 式细胞仪检测。唯一的rAAV2-GFP转导的细胞作为阳性对照，而未转导的细胞用作阴性对照。*，P 0.05;根据双尾 t检验，假设方差不等。该柱状图代表标准偏差（n= 3 ）。）10

31、0En-PCDE ndraUJou2CDMe-CDEn-P lu Tn-。一 poeuossajdxa ZE du-oo onepH 6.0J hydrogel* pH 7.4-1 PEG-polyHispH 6.0-J hydrogel57.5Time (week)(_0c0。=sodoa)d)AouoottoUOQOnpsue-（图3. （a） GFP-表达的细胞通过PEG或PEG-聚组氨酸水凝胶输送rAAV2-GFP的转染效率（%）的动力学因素（20 %多聚组氨酸，w/v ）在不同pH值时，这些水凝胶和细胞通过一个Transwell小膜分离。（b） GFP mRNA 表达量在酸性 pH介

32、质中的比率（pH 6.0 ）中相对于正常pH值介质（pH 7.4 ）中进行比较。 总mRNA分离和测定GFP的表达由GEPRT-PCR （ qRT-PCR ）分析。该柱状图代表平 均值土标准偏差（n=3）。）9244（图4.使用荧光显微镜观察rAAV2-GFP转导HT-1080细胞，当PEG或PEG-聚组氨酸的水凝胶水凝胶（20 %聚组氨酸，w/v ）的水凝胶和细胞通过一个transwell小膜隔开。该嵌入了rAAV2-GFP的PEG或PEG-聚组氨酸水凝胶液在pH为6.0的环境下和共培养细胞2周的时间。柱状条 =50mm。）聚氨酸）在发病潜伏期间下降（图5 ）。100() SS。二 U91)

33、M3.3.由PEG聚组氨酸水凝胶长期释放rAAV2-GFP为在目标部位延长滞留时间并以可控的方式释放病毒载体， 可以优化基因表达的持续时间、提高转基因的效率、并提高生 理反应和改善病人的反馈。因此应该测量在10周为一个周期从水凝胶中释放的rAAV2。每十周对HT-1080细胞培养在 pH6.0或7.4的环境中与含有 rAAV2-GFP 的PEG或PEG聚组氨 酸（20 %多聚组氨酸）的水凝胶进行分析，每周对表达GFP的细胞的强度进行分析。如图3a所示，传导效率在潜伏期逐渐增加。在十周后，多聚组氨酸在水凝胶组合物中的重要性可 以通过在 pH 6.0的环境中达到 85 %的转导效率进行例证。这 比

34、pH 7.4的环境下的效率以及PEG水凝胶的效率大得多，表明了释放过程中模拟了与炎症相一致的酸化环境。相反的来说， 与无生物材料改性的病毒相比病毒嵌入到支架的方法减少了病 毒的转导活性10。GFP mRNA 在HT-1080细胞中的表达水平通过qRT-PCR 法进行定量检测。正如图3b中所示，GFP mRNA在HT-1080细胞中的表达水平与rAAV2-GFP的培养嵌入的 PEG-聚组氨酸的水凝胶在pH6.0-7.0的环境中的比率高于1.5，而从自由获得的形式rAAV2-GFP 或PEG水凝胶大约只有1.1。些结果表明，与PEG的水凝胶进行比较PEG-聚组氨酸水凝胶确实对pH值敏感传递效率将通

35、过荧光显微镜进一步证实（图4）.用PEG-聚组氨酸的水凝胶共培养后的细胞表现出比共培养后用PEG水凝胶更大的GFP表达3.4. PEG-聚组氨酸水凝胶的降解我们进一步分析了失重的水凝胶的培养多在环境pH为6.0的10周之内。而 PEG和PEG-polyHis水凝胶的重量（含 20 %806040（图5:包含聚组氨酸的 20 %以上的失重，在pH6.0，37 C环境下的PBS溶液为期10周的潜伏期的PEG水凝胶和除pH为7.4 外其它条件相同下PEG-聚组氨酸水凝胶的无差别对比，图中柱状代表平均值土标准偏差（n=3）。）0 I 01251020Incorporation of polyHis r

36、atio(%, w/v)（图6 :用水凝胶培养后 HT-1080细胞活力图示。将细胞暴露于 在培养基的PEG或PEG-聚组氨酸水凝胶中，在 24小时中， PH7.4的环境下通过MTS测定来确定生存能力。细胞没有水凝胶 曝光被用来作为对照组。图中柱状代表平均值土标准偏差 （n=3）。）此外，失重的 PEG-聚组氨酸凝胶（90.4 %）显著大于 PEG水 凝胶（67.0 %）。然而，失重的 PEG和PEG-聚组氨酸水凝胶液 在环境pH为7.4的10周内无统计学差异（数据未示出）。.总而言之，这些结果表明，聚组氨酸的掺入可以提高PEG水凝胶的吸水能力，在PH6.0的环境条件下，增加了降解速率和增强了

37、 PEG-聚组氨酸水凝胶的病毒释放速率。PEG-聚组氨酸水凝胶的细胞毒性在基因递送或组织工程中所用的水凝胶必须是低毒性36。我们将以HT-1080细胞与MTS法细胞在24小时的培养后测定 PEG和PEG-聚组氨酸的水凝胶的细胞毒性。细胞中无水凝胶 的将被用来作为对照组。然而观察含有PEG水凝胶的HT-1080细胞的存活率没有显著差异（图.6 ）.聚组氨酸会对细胞活力产生一定的影响，然而当冬聚组氨酸掺入时影响就变得显著。掺 入20 %多聚组氨酸的 PEG-聚组氨酸水凝胶在经过10周制备后，细胞活力保持在 80 %以上。水凝胶的细胞毒性可能是由于残留的未反应单体、低聚物或 过程中释放的引发剂产生。

38、因此，对水凝胶的合成中使用单独 的前体细胞毒的作用进行认识是很重要的。在这个研究中，我 们分别使用聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂（2-羟基-40- （ 2-羟基乙氧基）-2-甲基苯）和聚赖氨酸在终浓度为0.02、0.05、和10 %（ w/v ），合成了所需要的PEG水凝胶。人们普遍认为基于PEG的水凝胶对细胞是高度细胞相容性和具有低的细胞毒 性37.另外，从基于 PEG的水凝胶释放的降解产物通常是无 毒的38.光引发剂2 -羟基-40 -（ 2 -羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮在低浓度（0.01 %，W/ V ）的条件下是具有细胞 相容性的39,然而，它的细胞毒性跟随浓度的的增加而增加 40.由

39、于PEG-聚组氨酸的水凝胶的溶胀率和降解速率明显高 于所述PEG水凝胶的高（图1及图5）,这些结果表明，在从 PEG-聚组氨酸水凝胶释放的水凝胶残留的光引发剂明显比从 PEG水凝胶的释放速度更快，从而导致在PEG-聚组氨酸的水凝胶表现出较高的细胞毒性。在多种情况下，官能化的水凝胶对 pH有着良好反应的能 力已得到证实。通过替代合成方法或水凝胶的纯化来提高生 物相容性的纯化，比如pH值敏感的材料来进行病毒传递应用具有广阔的前景。总结可生物降解和 pH敏感的PEG-聚组氨酸水凝胶具有高效率 和本地化基因转移的被开发潜力。pH依赖性的溶胀率以及对PEG-聚组氨酸水凝胶的降解速率的控制，可以通过包含聚

40、组氨 酸的程度来进行。该 rAAV2-GFP被嵌入到PEG-聚组氨酸水凝 胶中，然后有效地从在酸性环境中的水凝胶中释放。被释放的 rAAV2-GFP 能有效和环境针对性的转移基因。 这种PEG-聚 组氨酸的水凝胶具有广阔的潜力，例如在炎症部位的基因传递， 可促进组织再生和愈合。致谢这项工作是由台湾科学委员会( NSC97-2917-I-007-102)，台湾，中华人民共和国资助。参考资料Zhou J, Liu J, Cheng CJ, Patel TR, Weller CE, Piepmeier JM, et al. Biodegradable poly(amine-co-ester) ter

41、polymers for targeted gene delivery. Nat Mater 2011; 11:82 e90.Lindberg MF, Carmoy N, Le Gall T, Fraix A, Berchel M, Lorilleux C, et al. Thegene transactionproperties of a lipophosphoramidate derivative with twophytanyl chains. Biomaterials 2012;33:6240e 53.Guo XD, Wiradharma N, Liu SQ, Zhang LJ, Kh

42、an M, Qian Y, et al. Oligomerizedalpha-helicalKALA peptides withpendantarmsbearingcell-adhesion, DNA-binding andendosome-bufferingdomainsasef fi cient gene transfectionvectors. Biomaterials 2012;33:6284 e 91.Tseng SJ, Tang SC. Synthesis and characterization of the novel transfectionreagent poly(amin

43、o ester glycol urethane). Biomacromolecules 2007;8: 50 e 8.Mingozzi F, High KA. Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress and challenges. Nat Rev Genet 2011;12:341 e55.Flotte TR, Trapnell BC, Humphries M, Carey B, Calcedo R, Rouhani F, et al.Phase 2 clinical trial of

44、a recombinant adeno-associated viral vector expressing alpha1-antitrypsin:interim results. Hum Gene Ther 2011;22:1239 e 47.Chulay JD, Ye GJ, Thomas DL, Knop DR, Benson JM, Hutt JA, et al. Preclinicalevaluation of a recombinant adeno-associated virus vector expressing human alpha-1 antitrypsin made u

45、sing a recombinant herpes simplex virus production method. Hum Gene Ther 2011;22:155 e 65.Yue TW, Chien WC, Tseng SJ, Tang SC. EDC/NHS-mediated heparinization ofsmall intestinal submucosa for recombinant adeno-associated virus serotype 2 binding and transduction. Biomaterials 2007;28:2350e 7.Jang JH

46、, Schaffer DV, Shea LD. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther 2011;19:1407 e 15.Shin S, Shea LD. Lentivirus immobilization to nanoparticles for enhanced andlocalized delivery from hydrogels. Mol Ther 2010;18:700e 6.Kidd ME, Shin S, Shea LD. Fibrin hydrogels

47、for lentiviral gene delivery in vitroand in vivo. J Control Release 2012;157:80 e 5.Koefoed M, Ito H, Gromov K, Reynolds DG, Awad HA, Rubery PT, et al. Biological effects of rAAV-caAlk2 coating on structural allograft healing. Mol Ther 2005;12:212 e 8.Ito H, Koefoed M, Tiyapatanaputi P, Gromov K, Go

48、ater JJ, Carmouche J, et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL TOC o 1-5 h z and VEGF gene therapy. Nat Med 2005;11:291e 7.Bellocq NC, Kang DW, Wang X, Jensen GS, Pun SH, Schluep T, et al. Syntheticbiocompatible cyclodextrin-based constructs for local gene delive

49、ry to improve cutaneous wound healing. Bioconjug Chem 2004;15:1201e 11.Bazan-Peregrino M, Arvanitis CD,Rifai B, SeymourLW, CoussiosCC.Ultrasound-induced cavitation enhancesthe delivery andtherapeuticeffi cacyof anoncolytic virus in an in vitro model. J Control Release 2012;157:235e42.Carlisle RC, Br

50、iggs SS, Hale AB, Green NK, Fisher KD, Etrych T, et al. Use ofsynthetic vectors for neutralisingantibody resistant deliveryofreplicatingadenovirus DNA. Gene Ther 2006;13:1579 e86.Carlisle RC, Benjamin R, Briggs SS, Sumner-Jones S, McIntosh J, Gill D, et al. Coating of adeno-associated virus with rea

51、ctive polymers can ablate virus tropism, enable retargeting and provide resistance to neutralising antisera. J Gene Med 2008;10:400 e 11.Bertrand E, Goncalves C, Billiet L, Gomez JP, Pichon C, Cheradame H, et al.Histidinylated linear PEI: a new effi cient non-toxic polymer for gene transfer.Chem Com

52、mun 2011;47:12547e 9.Chang KL, Higuchi Y, Kawakami S, Yamashita F, Hashida M. Development oflysine-histidine dendronmodi fi ed chitosan for improving transfection effi -ciency in HEK293 cells. J Control Release 2011;156:195 e202.Schuwer N, Klok HA. Tuning the pH sensitivity of poly(methacrylicacid)b

53、rushes. Langmuir 2011;27:4789 e 96.Liu R, Li D, He B, Xu X, Sheng M, Lai Y, et al. Anti-tumor drug delivery ofpH-sensitive poly(ethylene glycol)-poly( L-histidine-)-poly( L-lactide)nanoparticles. J Control Release 2011;152:49 e56.Choi I, Suntivich R, Plamper FA, Synatschke CV, Muller AH, Tsukruk VV.

54、 pH- TOC o 1-5 h z controlled exponential and linear growing modes of layer-by-layer assemblies of star polyelectrolytes. J Am Chem Soc 2011;133:9592e606.VillanuevaI, Weigel CA, Bryant SJ. Cell-matrix interactionsand dynamicmechanicalloading in fl uence chondrocyte gene expression and bioactivity in

55、PEG-RGD hydrogels. Acta Biomater 2009;5:2832e 46.Song A, Rane AA, Christman KL. Antibacterial and cell-adhesive polypeptideand poly(ethylene glycol) hydrogel as a potential scaffold for wound healing. Acta Biomater 2012;8:41e 50.Hartgerink JD, Beniash E, Stupp SI. Peptide-amphiphile nanofi bers: a v

56、ersatilescaffold for the preparation of self-assembling materials. Proc Natl Acad Sci US A 2002;99:5133 e8.Lutolf MP, Tirelli N, Cerritelli S, Cavalli L, Hubbell JA. Systematic modulation of Michael-type reactivity of thiols through the use of charged amino acids. Bioconjug Chem 2001;12:1051 e 6.Tse

57、ng SJ, Chien C-C, Liao Z-X, Chen H-H, Kang Y-D, Wang C-L, et al. Controlledhydrogel photopolymerization inside live systems by X-ray irradiation. Soft Matter 2012;8:1420 e 7.Dalsin JL, Hu BH, Lee BP, Messersmith PB. Mussel adhesive protein mimeticpolymers for the preparation of nonfouling surfaces. J Am Chem Soc 2003; 125:4253 e8.Ganong WF. Review of medical physiology. 12th ed.