等位基因特异性PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变

1、等位基因特异性-PCR团结限定性内切酶消化法检测JAK2V617F突变申徐良陈方平魏武张梅香史文芝秦小琪徐嘹亮【摘要】目的：创立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测要领。要领：基因组DNA从HEL细胞或正常志愿者外周血中提龋接纳等位基因特异性-PRAllelespeifi-PR，AS-PR和限定性内切酶消化的要领检测基因组中JAK2V617F突变。效果：本AS-PR法可对JAK2基因扩增出364bp的内参照条带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203bp的突变条带。只有野生型内参照条带364bp可被BsaX消化切割。结论：ASPR法和限定性内切酶法是检测JAK2V617F突

2、变的敏感特异的检测要领，可以乐成应用于临床检测。【关键词】等位基因特异性-PR；JAK2V617F突变；限定性内切酶BsaXAbstratbjetive:TestablishasensitiveandspeifitestfrJAK2V617Fpintutatin.ethds:GeniDNAasislatedfrHELellsrPeripheral-bldellsfrnralvlunteer.Allele-speifiplyerasehainreatins(AS-PR)andrestritinenzyedigestinereperfredtdetettheutatiningeniDNA.Resu

3、lts:Antrlband(364bp)anbebtainedbyAS-PR,andautedband(203bp)anbebtainednlyhenJAK2V617Faspresented.nlyildtypentrlband(364bp)anbedigestedbyrestritinenzyeBsaX.nlusin:AS-PRandrestritinenzyedigestineresensitiveandspeifitestsfrJAK2V617Fpintutatin,andanbesuessfullyusedfrlinialtest.KeyrdsAllelespeifi-PR;JAK2V

4、617Futatin;RestritinenzyeBsaXJAK2基因属JAKs(Januskinases/Justantherkinases)家属成员，是胞浆非受体性酪氨酸激酶,在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用。2022年，Baxter和Kralvus先后创造大部门骨髓增殖性疾病患者携带有一个得到性的JAK2基因突变-JAK2V617F，该基因突变位于JAK2基因第1849位，本来的鸟嘌呤G被胸腺嘧啶T所代替，导致原位于617位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸(GT,JAK2V617F)。该突变的阳性率在PV中高达65%97%、ET为23%57%和IF为35%57%，在AL/L中有少量

5、表达6。JAK2V617F基因突变的创造是比年来骨髓增殖性疾病发病机制的打破性希望，因此有学者将其称为骨髓增殖性疾病的“JAK2期间。JAK2V617F的创造对付临床上骨髓增殖性疾病的诊断和区分诊断有非常紧张的意义。为此，我们在临床上创立了两种敏感特异的JAK2V671F点突变的检测要领等位基因特异性PR法Allelespeifi-PR，AS-PR和限定性内切酶消化法。这两种要领的应用，有利于进步骨髓增殖性疾病的临床诊断程度。1质料与要领1.1细胞造就HEL细胞株购自中国科学院上海科学研究院，造就于含10%胎牛血清(Hylne)、100U/L青霉素，100U/L链霉素的RPI1640(Gib)

6、造就基中，置于37、5%2、饱和湿度的造就箱中造就，每3d换液一次。待细胞生长至80%汇适时以13的比例传代，取对数生恒久的细胞用作实行。1.2基因组DNA制备HEL细胞基因组和正凡人血液基因组DNA用血液基因组提取试剂盒上海生物工程公司产物提龋1.3AS-PR及产物阐发PR引物合成事情由北京奥科生物公司完成。各引物序列如下：公用反向引物(R1)5-TGAATAGTTAAGTGTTTTAGTTTA-3、野生型正向引物(F1)5-ATTATAGTATGTGAAAGTAGGAGAAAG-3364bp、突变特异性正向引物(F2)5-AGATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3203

7、bp。PR反响体系为50L,每管中参加80ngDNA模板，公用反向引物(10)1L，突变特异性正向引物(10)1L或野生型正向引物(10)1L，10XPR缓冲液5L，25gl23L，10dNTPs1L，5U/L的Taq聚合酶1L，末了用去离子水补足50L。置于JResearhPT-100基因扩增仪中按以下步伐扩增:先94变性11in,然后举行扩增循环，包罗变性40s94、退火1in54、和延伸1in72，扩增35循环，末了72延伸10in。AS-PR产物经2.0%琼脂糖凝胶含EB电泳断定，应用AlphaEaseF凝胶成像处置惩罚体系不雅察并阐发效果。BsaX限定性内切酶为NEB公司产物。酶切反

8、响体系：PR产物20L，NEBBuffer44L，BsaX1L2U，去离子水15L，总体积40L，37温育4h。酶切完毕后于2琼脂糖凝胶中电泳不雅察效果。2效果HEL细胞株是人红白血病细胞株，有学者6证明HEL细胞为JAK2V617F基因突变的纯合子。因此，在本实行中我们以HEL细胞作为一个的含有JAK2V617F突变的的阳性标本，用于创立JAK2V617F突变的检测要领。AS-PR历程中野生型正向引物(F1)5-ATTATAGTATGTGAAAGTAGGAGAAAG-3和公用反向引物(R1)5-TGAATAGTTAAGTGTTTTAGTTTA-3别离位于基因组上该突变位点的上游和卑劣，扩增产

9、物为364bp，该扩增作为AS-PR的阳性比较，用于查验基因组DNA提取的质量和PR体系的准确性。无论基因组中是否存在JAK2V617F突变，只要提取的基因组DNA完备，PR体系准确，这两条引物都可以扩增出364bp的产物。突变特异性正向引物(F2)5-AGATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3是针对突变位点方案的突变引物，该引物3端包罗2个错配的核苷酸。当基因组中存在JAK2V617F突变时，该引物与公用反向引物(R1)可以扩增出203bp的产物，当基因组中不存在JAK2V617F突变时PR不克不及扩增。图1为AS-PR的效果，在该图中可以看到野生型正向引物(F1)和公用

10、反向引物(R1)扩增出的条带位于300bp和400bp之间364bp，同时突变特异性正向引物(F2)与公用反向引物也扩增出一条清楚锐利的条带，巨细为200bp摆布203bp。2.2BsaX酶切阐发限定性内切酶法所接纳的限定性内切酶是BsaX。BsaX识别序列为：5-NNNNNNNGGAGNNNNNGTNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNN-5在我们扩增的364bp的AS-PR产物中该酶的识别序列为：5-AAATTATGGAGTATGTGTTGTGGAGAGA-33-AAATTTAATATATAAAGAATT-5BsaX可将野生型的364bp的PR产

11、物切割为174bp，160bp，30bp三个片断。在2的琼脂糖凝胶中30bp的片断区分不清，174bp产物和160bp的产物难以分开而聚拢成一条带图2，lane1。起首用野生型正向引物(F1)和公用反向引物(R1)对HEL细胞的基因组DNA举行扩增，得到364bp的扩增产物，然后将该产物用BsaX切割，电泳效果如图2所示：正凡人的比较PR产物被切割为174bp和160bp的两个片断，而HEL细胞的PR产物不克不及被切割。3讨论可以检测JAK2V617F点突变的要领许多，比方，AS-PR法,限定性内切酶消化法和直接测序法等，差异的要拥有差异的特点和良好性。等位基因特异性PR最大的长处是敏感性高，

12、只必要少少量的模板DNA便可以得到很好的效果。限定性内切酶要领的检测敏感性不及AS-PR法，其长处在于轻便易行，消耗不高，而且可以作为一个高通量挑选的要领。测序法固然可以或许提供应我们正确的序列信息，但是由于色谱图配景的影响其敏感性有限。而且该要领耗时耗力，消耗比力高，必要一些特别的仪器装备，在临床检测方面的应用照旧有必然的困难。其他检测要领如及时定量PR法和DNA融解曲线阐发法焦磷酸测序法和质谱法等，利用者较少。我们以HEL细胞系作为JAK2V617F突变的阳性比较，应用突变特异性引物(F2)(3端包罗2个错配的核苷酸，使得野生型JAK2的难以扩增)对突变基因举行扩增，此后我们又对突变DNA序列举行了限定性内切酶阐发，表白这两种要领比力敏感而且特异性强。我们的履历提示：在一样平常环境下，80ng基因组DNA经35个循环扩增后就可以看到显着的条带。假设参加模板太多，大概会扩增出一些与目的条带分子量差异的非特异条带，而小于40ng的基因组DNA那么必要增长循环(大概增长假阳性率)才气检测到；退火温度的选择对付实行的乐成黑白常紧张的，58是比力相宜的退火温度。假设退火温度高于60时突变特异性引物(F2)将不克不及扩增出显着的条带