EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能

1、EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能【关键词】EBNA2nstrutinfeukarytiexpressinvetrfEBNA2andfuntinaldetetinfitsprdut【Abstrat】AI:TnstruttheeukarytiexpressinvetrfEBNA2andtexpressitineukarytiellsanddetetthefuntinfitsprdut.ETHDS:EBNA2geneasbtainedbyPRandDNArebinatinfrtheplasidpSG5EBNA2.PRprdutfEBNA2bastheninsertedintplasi

2、dpD18Tandsequened.ThefulllengthEBNA2geneasutandinsertedinteukarytiexpressinplasidpVHA.UsingLipfetaineT2000,theplasidpVEBNA2astransfetedints7andthendetetedbyesternbltandiunfluresene.TheativityfEBNA2asdetetedbyluiferasereprterassay.RESULTS:TheEBNA2geneassuessfullylnedanditssequeneasidentialtthatinGenB

3、ank.AfterplasidpVEBNA2astransfetedints7,theexpressedprdutfEBNA2asdetetedbyesternbltandiunfluresene.ThetransriptinalativityfEBNA2asdenstratedbyreprterassay.NLUSIN:TheeukarytiexpressinvetrpVEBNA2hasbeensuessfullynstrutedandsuessfullyexpressedineukarytiellline.TheEBNA2prtEinhastransriptinalativatin.【Ke

4、yrds】EBNA2;lne;expressin;genetivetr【摘要】目的：构建EB病毒核心抗原2EBNA2的真核表达载体，在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能.方法：应用DNA重组和PR方法从质粒pSG5EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因，插入到真核表达载体pVHA中.应用脂质体的方法将重组质粒pVEBNA2瞬时转染s7细胞，通过esternblt和免疫荧光方法检测EBNA2的表达.应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性.结果：克隆EBNA2的编码基因，经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染s7细胞，EBNA2基因

5、的表达产物通过esternblt和免疫荧光方法得到证实.荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性.结论：成功构建EBNA2的真核表达载体，证实其在真核细胞s7可以表达，并具有转录激活功能.【关键词】EBNA2基因；克隆；表达；遗传载体0引言EB病毒核心抗原2EBNA2的编码产物是EB病毒体外感染细胞时最先表达的蛋白，作为一种转录因子，它可以调节病毒及细胞内多种基因表达，如LP1，LP2A1，D21，D23及y等，同时还可以抑制细胞免疫球蛋白重链的转录.Nth信号途径是体内一个非常保守的信号途径，在体内分布非常广泛2.EBNA2可以与Nth信号途径中的重要分子RBPJ相结合，激活下游靶基

6、因，并通过模拟Nth信号途径对体内淋巴细胞的分化和发育方向起调控作用3.同时EBNA2还可以促进抑癌分子p53的磷酸化4，调节癌基因的表达.我们对EBNA2基因进展了克隆，并在真核细胞中表达，为进一步讨论其对小鼠免疫系统发育过程的影响奠定根底.1材料和方法1.1材料大肠杆菌XL10；质粒载体pVHA，pBlusript-，pGA9816为本室保存.载体pD18T购自TaKaRa公司.s7细胞为本室保存.脂质体LipfetaineT2000及细胞培养试剂均购自Invitrgene公司.抗EBNA2抗体购自Dak公司，HRP标记抗小鼠IgG,FIT标记抗小鼠IgG购自博士德公司.小量质粒提取试剂盒

7、、DNA胶回收试剂盒均购自华瞬生物工程公司.PR试剂盒、各种限制性内切酶购自TaKaRa公司.根据GenBank中EBNA2基因的序列，设计2条引物：引物2的5端参加Xh位点，引物1和引物2用于扩增EBNA2基因的3端局部EBNA2b.引物1：5TGGGGAATGGTGG3；引物2:5GTGAGTTATGGATGGAGGGG3.1.2方法1.2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建ER/Bgl/Sal三酶切质粒pSG5EBNA2，胶回收4.0kb大小片段，将回收片段插入经ER/BaH双酶切开的pBlusript-载体中，命名为pBSSKEBNA2.以pSG5EBNA2为模板，用引物1和引

8、物2进展常规PR反响，扩增EBNA2基因的3局部EBNA2b.PR反响条件：于94变性5in后，按以下参数循环35次：即94变性30s，60退火30s，72延伸30s，最后于72延伸7in.PR产物克隆到pD18T载体中，N/Xh酶切鉴定阳性克隆，命名为pDEBNA2b.用N/Xh从pDEBNA2b中切下EBNA2b片段插入用N/Xh切开的pBSSKEBNA2载体pBSSKEBNA2a中，N单酶切和ER/Xh双酶切鉴定，命名为pBSSKEBNA2a+b.pVEBNA2用ER/Xh双酶切质粒pBSSKEBNA2a+b，回收1500bp片段，将其插入ER/Xh切开的pVHA载体中，酶切鉴定阳性克隆

9、，命名为pVEBNA2.1.2.2EBNA2表达的检测esternblts7细胞于转染前1d接种于直径60中皿，接种4105个细胞,接种16h后，应用LipfetaineT200010L转染质粒pVEBNA24g.转染60h后裂解细胞搜集蛋白上清，参加2加样缓冲液，煮沸5in.然后进展120g/LSDSPAGE电泳，于180A稳压状态下转膜3h.于室温用20g/L蛋白干粉封闭1h后，一抗antiEBNA2110004过夜.PBST洗涤3次，每次5in.二抗抗鼠IgGHRP14000室温作用1h，同上洗涤后，进展放射性显影.免疫荧光s7细胞于转染前1d接种于直径60中皿，于皿底事先参加圆形玻片，

10、转染过程同上，对照组转染质粒pVHA.转染60h后取出爬有细胞的玻片，PBS洗涤3次，每次5in；10g/LBSA37封闭1h；一抗antiEBNA2120037避光湿盒中染色1h；同上洗涤；二抗抗鼠IgGFIT150037避光湿盒中染色1h；同上洗涤后，荧光显微镜观察.1.2.3共转染报告质粒检测荧光素酶强度细胞准备和转染过程同上，对照组转染：pGA98160.2g，gal0.2g，pVHA1.6g；检测组转染：pGA98160.2g，gal0.2g，pVEBNA20.2g，pVHA1.4g.转染48h后收细胞.反复液氮中冻溶裂解，充分震荡混匀，样品与反响底物15比例混合后，照度仪中检测荧光

11、素酶强度.2结果2.1EBNA2基因的克隆及真核表达载体的构建以质粒pSG5EBNA2为模板,PR扩增EBNA2基因的3端局部称为EBNA2b(494bp),回收后插入载体pD18T中,获得重组质粒pDEBNA2b,经过测序,结果证实与GenBank中的相对应局部序列完全一致.应用限制性内切酶将EBNA2基因的5端局部EBNA2a插入载体pBluesript(-),获得重组质粒pBSSKEBNA2a,经过拼接最终获得重组质粒pBSSKEBNA2,酶切鉴定,结果完全符合实验设计.重组质粒pBSSKEBNA2和质粒pVHA分别用ER/Xh双酶切后，进展连接转化，获得重组质粒pVEBNA2图1，经酶

12、切鉴定图2正确ER/Xh1470；N928.图1重组质粒pVEBNA2图2重组质粒pVEBNA2的酶切鉴定2.2EBNA2的检测质粒pVEBNA2应用脂质体转染s7细胞，转染60h后，收取蛋白上清，esternblt检测EBNA2蛋白的表达，可在r85000处见一条特异性条带图3，条带大小符合预期.质粒pVEBNA2和pVHA应用脂质体转染s7细胞爬片，转染60h后，取出爬片，免疫荧光检测EBNA2蛋白的表达.在荧光显微镜下放大20倍时,对照组仅有微弱的非特异荧光，转染组那么可见较强荧光(图4).图3esternblt检测EBNA2的表达图4免疫荧光检测EBNA2的表达202.3EBNA2荧光

13、素酶检测质粒pVEBNA2和报告质粒pGA9816用脂质体lipfetaineT2000共转染s7细胞，转染48h后，反复冻融裂解，收取蛋白上清，与作用底物15混合后，于照度仪上检测荧光素酶强度，结果可见共转组与对照组结果存在显著性差异，共转染组是对照组的50倍左右.3讨论1964年，英国生物学家EpstEin和Barr从Burkitt淋巴瘤中别离得到一种疱疹病毒5，命名为EB病毒，EBNA2是EB病毒所表达的9种功能性蛋白之一.在EB病毒感染B淋巴细胞过程中，EBNA2作为关键性的转录因子，通过激活细胞和细菌内的多种靶基因，可以使B淋巴细胞形成永生化.RBPJ在与nth信号途径胞内段NthI

14、结合后可以激活下游基因，调节体内的多种生理功能，如造血干细胞的分化，神经元的形成，T/B细胞的发育等6.近年来的研究说明，EBNA2是NthI的一种功能性同源蛋白，它的保守区5和保守区6可以结合于RBPJ的相应区域7，起到类似NthI的作用，模拟Nth途径激活下游靶基因.我们成功地从质粒pSG5EBNA2中再克隆得到了EBNA2基因的全长序列，并插入到真核表达载体pVHA，在真核细胞中得到表达.经过对质粒pSG5EBNA2的5端编码序列测序，我们发如今EBNA2开放读框起始密码子ATG之前存在一个ER位点，所以我们以EBNA2读框中段的N酶切位点为分界点，将EBNA2分为a和b两局部，5端编码

15、序列采用酶切获得，3端编码序列采用PR获得，然后再将其拼接成完好读框方法最终得到EBNA2基因的完好序列.EBNA2基因插入HA标签的下游，中间间隔ERI位点，所以HA和EBNA2基因分别独立表达.在检测EBNA2蛋白表达的实验中，我们可以看到esternblt的结果条带出如今r85103左右的位置，这与EBNA2蛋白r53103存在较大出入.这主要是由于在EBNA2蛋白中含有28%的脯氨酸，使其分子的二级空间构造变大，EBNA2蛋白在凝胶中迁移速度变慢所造成的.在检测荧光素酶激活强度的实验中，共转染组约是对照组的50倍左右，充分说明EBNA2蛋白具有转录激活活性.综上所述，我们克隆得到了EB

16、NA2的全长基因，并证实其在真核表达系统中可以表达，为以后将其克隆入其他表达载体，进展进一步的功能研究提供方便，为进一步讨论EBNA2对免疫系统发育的影响奠定了根底.【参考文献】1SungNS,KenneyS,GutshD,etal.EBNA2transativatesalyphidspeifienhanerintheBaHIprterfEpsteinBarrvirusJ.JVirl,1991,65:2164-2169.2ArtavanisTsaknasS,atsunK,FrtiniE.NthsignallingJ.Siene,1995,268:225-232.3SakaiT,Taniguhi

17、Y,TauraK,etal.Funtinalreplaeentftheintraellularreginfthenth1reeptrbyEpsteinBarrvirusnulearantigen2J.JVirl,1998,6034-6039.4LinS,KuHH,angB，etal.EpsteinBarrvirusnulearantigen2retardsellgrth,induesp21AF1expressin,anddulatesp53ativitypsttranslatinallyJ.JlBil,2000,303,7-23.5KppersR.Bellsunderinfluene:TransfratinfBellsbyepsteinbarrvirusJNatRevIunl,2022,10(