雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究

1、雷帕霉素靶卵白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究侯桂琴，鲁照明，穆欣，刘洪涛，刘兰琦，许培荣，薛乐勋，王建人【摘要】目的研究雷帕霉素靶卵白TR信号传导通路在食管鳞癌细胞系E9706和Ea109中的激活状态。要领接纳细胞免疫组化检测TR及其卑劣靶分子p70S6K在两细胞系中的表达，并接纳RT-PR和esternblt要领别离从RNA程度及卵白程度测定此通路的活性。效果TR在两种细胞系中均有表达，且在E9706中的表达程度显着高于Ea109，TR卑劣靶点p706S6K的磷酸化程度也是E9706显着高。结论TR信号通路在两种细胞系中都是特异性激活。激活状态与细胞的分化程度有关，细胞分化程度越低，

2、通路的激活程度越高。【关键词】食管肿瘤雷帕霉素靶卵白p70S6激酶细胞株Keyrds:esphagealneplass;aaliantargetfrapayin;p70S6K;elllines哺乳动物雷帕霉素靶卵白aaliantargetfrapayin，TR是比年来创造的一种进化上守旧的卵白激酶，到场多种病理和生理历程，是细胞生长的中央调控因子。p70S6激酶p70S6K及4E-BP1是TR的直接作用底物，被TR磷酸化后激活，从而操纵含5-TP布局的RNA的翻译。TR信号通路在细胞的保存、生长与增殖中起中央调控作用，它所介导的信号传导通路的非常与多种恶性肿瘤有关，已成为肿瘤治疗的新靶点1。食

3、管鳞癌是我国的常见恶性肿瘤之一24，但有关食管鳞癌TR的研究在国表里尚未见报道。本文拟从RNA及卵白程度验证TR/p70S6K信号通路在食管癌中的存在环境，为从分子程度治疗食管癌打基矗1质料与要领1.1质料抗体及试剂：HRP标识表记标帜羊抗鼠IgG、S-P试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技能公司；DNALadder阐发试剂盒购自碧云天生物公司；TR、P70S6K抗体及p-P70S6K抗体购自美国Santruze公司；反转录试剂盒购自上海生工生物公司；Taq酶和dNTP购自负连宝生物；引物由上海生工生物公司合成。细胞系：高分化食管鳞癌细胞系Ea109由本室保存，低分化食管鳞癌细胞系E97

4、06由中国医学科学院肿瘤病院肿瘤研究所分子肿瘤学国度重点实行室惠赠，阳性比拟宫颈癌细胞系HeLa229购自中国科学院上海生物所细胞库。1.2要领细胞造就：三株细胞在含有10%的胎牛血清，100U/l青霉素，100g/l链霉素的1640造就液Gib公司中生长，并置于37，5%2的条件下造就，实行细胞均处于对数生恒久。细胞爬片剂备及免疫细胞化学：将无菌处置惩罚的盖玻片匀称铺于六孔板中，接入细胞悬液，留宿造就使细胞达80%交融，吸出造就基，用PBS洗三遍，参加多聚甲醛结实20in，制成细胞爬片，然后按免疫组化试剂盒说明操纵。TR与p70S6K抗体均1100稀释。RT-PR：Trizl法提取细胞总RN

5、A并举行反转录。方案引物，RT-PR法阐发TR及p70S6K的表达。用Gentl举行灰度阐发并统计学处置惩罚。引物方案如下：TR：上游P1:5GTGTATTTTATG3；卑劣P2：5ATGTAAAATA3，长度为193bp。p70S6K：上游P1:5TATTGGGTATTGGTAA3；卑劣P2：5GATGAAGGGATGTTTAT3，长度为188bp。4E-BP1:上游P1：5AGGAAATTTGATGGAG3；卑劣P2：5GTTATTTTGGGTA3，长度为156bp。内参GAPDH:上游P1:5-GAGTAAGGTGAGAA-3；卑劣P2：5-AGGTAATGAAGTTG-3，长度为570

6、bp。esternblt：提取对数期生长细胞总卵白，用考马斯亮蓝尺度曲线法测卵白浓度,SDS电泳及esternblt阐发细胞中TR、p70S6K和p-p70S6K表达，卵白上样量均为50g。TR、p70S6K及p-p70S6K抗体稀释浓度均为1200，两种抗均体为15000稀释。TR转膜条件为湿转50A，16h；p70S6K和p-p70S6K转膜条件为半干转22V，100in，加一抗后4留宿。越日加二抗，室温下振摇1h，DAB染色。esternblt操纵步调参考?分子克隆操纵指南?。1.3统计学阐发2效果2.1TR及p-p70S6K在食管癌细胞系E9706和Ea109中的细胞免疫组化与Hela

7、229细胞比拟，在两种食管癌细胞株E9706和Ea109中TR和p-p70S6K均呈阳性，说明食管癌细胞中TR和p-p70S6K均为高表达。2.2esternblt从esternblt效果可以看出，两种细胞株中TR及p-p70S6K均有较强的表达，而p70S6K表达相对较弱图1。由于磷酸化的p70S6K比其非磷酸化状态的翻译活性要高约100倍，说明在两种细胞株中均存在TR信号传导通路的激活。从表1看出，TR在E9706及Ea109中的表达有显着差异(F=34.80，P0.05)；p-p70S6K在两种细胞株中的表达也有显着差异(F=56.29，P0.05)，表白两种细胞株中TR及p-p70S6

8、K表达程度差异，在E9706中的表达程度显着高于Ea109。2.3RT-PR效果从RT-PR效果可以看出，TRRNA在两种细胞株中也均有表达图2A，表2，统计创造，两种细胞株中TRRNA的表达有显着差异(F=13.85，P0.05)，且在E9706中的表达显着高于Ea109。而TR的两个卑劣紧张靶分子p70S6K和4E-BP1在两种细胞株中的表达也有差异(P0.05)，在E9706中的表达程度明凹凸于Ea109图2B、，表2。3讨论比年来的研究证明，TR信号通路在恶性肿瘤形成中起紧张作用，已成为肿瘤治疗的新靶点5，6。TR是G1细胞周期卵白合成的焦点调控者，在正常的细胞生长增殖中起到重要作用，

9、而且与细胞分化以及癌细胞的生长、增殖严密相干7。TR在多种肿瘤中被明显激活，而且TR可直接使p70S6K中Thr389磷酸化p-p70S6K，p-p70S6K促翻译活性超过未磷酸化p70S6K100倍摆布，从而促进卵白合成8，使细胞周期停滞促进细胞凋亡产生9。本试验以低分化的E9706和高分化的Ea109两种食管癌细胞株为研究工具，通过细胞免疫化学、esternblt及RT-PR初次证明了食管鳞癌细胞中存在高活性的TR，而且在E9706中无论是RNA照旧卵白水均匀高于Ea109，即细胞的分化程度越低，肿瘤的恶性程度越高，TR的激活程度越高；而TR卑劣的紧张靶点p70S6K和4E-BP1的磷酸化

10、程度越高，从而使细胞中卵白合成越快，即细胞生长越快，这又进一步加快了细胞的恶化。本研究效果说明白TR信号通路的激活在食管癌产生生长中的紧张职位。致谢：本研究在郑州大学河南省分子医学重点学科开放实行室完成。【参考文献】1PeneF,laesseneYE,uller,etal.Rlefthephsphatidylinsitl3-kinase/AKTandTR/p70S6-kinasepathaysintheprliferatinandapptsisinultipleyelaJ.ngene，2002,21(43):6587-6597.2BjrnstiA,HughtnPJ.TheTRpathay:at

11、argetfranertherapyJ.NatRevaner,2022,4(5):335-348.3AlbertJ,KiK,a,etal.TargetingtheAkt/aaliantargetfrapayinpathayfrradisensitizatinfbreastanerJ.lanerTher,2022,5(5):1183-1189.4ntesanR,HllstEin,HainantP.Genetialteratinsinesphagealanerandtheirrelevanetetilgyandpathgenesis:ArevieJ.IntJaner,1996,693:225-23

12、5.5FingarD,RihardsnJ,TeeAR,etal.TRntrlsellyleprgressinthrughitsellgrtheffetrS6K1and4EBP1/eukarytitranslatininitiatinfatr4EJ.leularandellularBilgy,2022,24(1):200-216.6rgenszternD,ledHL.PI3K/AKT/TRpathayasatargetfranertherapyJ.Anti-anerDrugs,2022,16(8):797-803.7TlherA.Nveltherapeutileulartargetsfrprstateaner:theTRsignalingpathayandepideralgrthfatrreeptrJ.JUr