免疫组化基础知识

1、免疫组织（细胞）化学基础知识分享定义免疫组化利用抗原和抗体之间的结合具有高度特异性，先将组织或细胞中某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中同类的抗原物质，由于抗原和抗体的复合物是无色的，因此使用的抗体多是进行标记后的抗体，以达到对组织或细胞中未知抗原进行定性、定位或定量的研究。免疫组织化学在病理诊断中的应用范围肿瘤诊断一未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别;转移肿瘤的原发部位的确定。2.淋巴瘤的诊断一鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。3内分泌肿瘤的诊断(检测肿瘤分泌的激素)4软组织肿瘤；神经系统肿瘤

2、5小活检组织病理检查(能明确显示瘤细胞存在与否)6微小癌、微小转移灶(淋巴结和骨髓)7细针穿刺(细胞学诊断)8.部分肿瘤来源分类9乳腺癌激素受体检测(ER,PR)10.肿瘤基因产物(p53,cerb-B2,ALK,CDs)增殖细胞核抗原(Ki-67,PCNA)判定肿瘤的预后12病因诊断(HBV,HCV,EBV,CMV,HIV等)抗原&抗体一、抗原的概念是一类在合适的条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质在体内和/或体外发生特异性结合反应的物质。抗原的性能：免疫原性一一产生免疫应答反应原性一一产生特异性反应完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质。不完全抗原或半抗

3、原：无免疫原性。二、抗原的种类分类依据种类单独存在时是否有免疫原性半抗原和完全抗原抗原来源外源性抗原和内源性抗原抗原与宿主关系异种抗原，同种异体抗原，目身抗原B细胞产生抗体时是百需要T细胞辅助胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原化学物质蛋白质，多穂，脂蛋白f脂多糖，糖蛋白,核酸等物理状态颗粒性坑原，可溶性坑原产生方式天然抗原，人工合成坑原，基因工程抗原抗原特异性程度特异性抗原，共同抗原抗体的制备方法多克隆和单克隆抗体三、抗体的概念机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白。四、抗体的种类分类依据种类抗体的一般性质免疫球

4、蛋白约等于抗体f分五类：IgGJgMJgAJgDJgE抗体的途径或来源不同免疫抗体；天然抗体；自身抗体抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应完全抗体；不完全抗体免疫组织化学的基本技术一、取材实验动物麻醉（处死）,锋利刀片切成大小适中，厚度3mm4mm。小型实验动物：灌注（流）固定后取材（生理盐水和4%多聚甲醛）人体材料活检组织、手术标本、细胞和组织二、固定原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为112h。1常用的定剂甲醛缓冲液广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细

5、胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露,固定时间不直超过24h。4%多聚甲醛磷酸缓冲液广泛应用于光镜细胞化学研究。戊二醛多聚甲醛缓冲液适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。其它如PLP液(过碘酸、赖AA、多聚甲醛固定液)、丙酮及醇类、娥酸等。2.固定注意事项(1)固定液的选择标准：A.组织形态结构保存良好。B.最大限度保存抗原的抗原性。组织块的大小:1.5cmX1.5cmX0.5cm为宜。固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时可放置在4C冰箱。固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。三、包埋石蜡包

6、埋2冷冻包埋3.环氧树脂包理四、切片1载玻片的处理（1）清洗（2）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：明胶：銘矶明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。多聚赖氨酸（PLL）o商品化粘附剂。2切片类型（1）石蜡切片：厚约35um,放置37C温箱烘烤过夜，以减少脱片。（2）冷冻切片：2umo（3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用较多。免疫组化染色过程中基本技术蛋白酶消化技术进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限

7、度地结合增强特异性染色。1常用的消化酶月夷蛋白酶、胃蛋白酶消化时间因组织而异，一般为530min,消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。3/非特异染色的控制非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。（1）原因分析组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等.试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。（2）消除方法力口1抗前加正常血清1030min,以封闭组织中带电荷的基因，避免与1抗的非特异性结合。常用染色方法分类1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性

8、同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法、免疫铁蛋白法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测免疫荧光细胞化学技术一、基本原理免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的

9、原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。二、荧光产生的原理分子都含有电子，电子载不断的运动着。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级（即激发态），这个过程叫激发。1、荧光色素一一能够产生荧光并能作为染料的化合物。特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光团。2、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件:1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。2）荧光

10、效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。4）与蛋白质结合的方法简便而快速。5）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。6）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。3、荧光素的类型异硫氧酸荧光素(fluotescienisothocyanate,FITC)四甲基异硫氧酸罗达明(tetraethylrhodamineisothocyanate,TRITC)四乙基罗达明(tetraethylrhodamine,RB200)其它三、免疫荧光染色方法1、直接法：用己知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体,直接用于细胞和

11、组织抗原的检查。优点：特异性高缺点：一种荧光抗体只能检测一种抗原。2、间接法：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（2抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原抗体荧光抗体的复合物。优点：荧光亮度增强，提高了敏感度四、非特异性染色1、非特异性染色的主要因素1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素腺蛋白，可与组织成分非特异结合。3）组织内类属抗原的存在。4）从组织中难以提纯抗原性物质。5）抗体分子上标记的荧光素太多。6）荧光素不纯，标本固定不当。7）细胞和组织内某些物质自

12、发荧光。8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。2、消除的方法1）衬染法（可抑制自发荧光）2）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光）3）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色）4）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光）5）提高抗体和荧光抗体的质量五、荧光显微镜观察六、染色标本的保存原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光最强。用缓冲甘油封片，保存在4C中，过夜后特异性荧光强度减弱25%,保存1周后减弱60%免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1.免疫酶染色用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）和双PAP

13、法等。（1）直接法原理：用酶直接标记在特异性1抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。（2）间接法原理：先用标记的特异性1抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（2抗）孵育，然后再加酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。如：1抗是由兔产生的多克隆抗体，贝吃抗常用羊抗兔IgG；1抗是由鼠产生的单克隆抗体，贝吆抗常用羊或马抗鼠IgG。以上两种方法称为酶标抗体法（3）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。通过酶与込的特异性结合进

14、行标记。该方法适用于石蜡包埋的组织切片。丄常用的有PAP、sABC、LsAB法sABC法的操作过程基本原理：sABC(strepto-avidin-biotinperoxidasecomplex)链球菌抗生物素(卵白蛋)生物素过氧化物酶复合物生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。抗生物素(avidin):是一种糖蛋白,分子量为68KDao生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素-一抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。附基本操作步骤ABC法基本

15、操作步骤步骤操作时间步骤操作时间ii11二甲苯脱蜡至水9PBS洗5minX320.3%H202甲醇阻断30min10加sABC室温3060min3流水洗11PBS洗5minX34PBS洗5minX312dab-h2o2反应液显色210/15min5110%正常血清封闭室温30min13流水洗6稀释的特异性一抗室温30-60min或4C过夜14核染色30slmin7PBS洗5minX315脱水透明封片8生物素标记的二抗室温30-60min免疫电子显微镜技术一、免疫电镜技术(immunoelectionmicroscopy)是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原

16、的技术方法。从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。到目前为止，己有三种标记技术：铁蛋白标记技术酶标记技术胶体金标记技术免疫金标记技术(immunogoldstainingtechnique)用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。附：免疫金标记技术的应用范E（1）免疫金标记技术是金探针作为抗体与组织和细胞内抗原发生抗原抗体特异性反应，使金颗粒附着在反应部位，定位准确，金颗粒电子密度很高，EM下清晰可辨。