南药高良姜基因组DNA提取方法的研究

1、南药高良姜基因组DNA提取要领的研究庞启华，严萍，赵翾，赵树进【摘要】目的提取高质量的高良姜基因组DNA，用于药材分子断定、分子体系分类和分子进化等卑劣分子生物学研究。要领在TAB改进法底子上，接纳4个方案提取DNA。结果用改进TAB法方案4提取的基因组DNA的D260/D280比值在1.82.0之间，产率为0.541.049g/g枯燥叶片。基因组DNA能被限定性内切酶ER和se完全酶切，经AFLP阐发，得到了条带清楚的DNA指纹图谱。结论用改进TAB法方案4提取的基因组DNA纯度高，切合分子生物学研究要求。【关键词】高良姜；基因组DNA；提取Keyrds:AlpiniaffiinaruHan

2、e;GeniDNA;Extratin高良姜AlpiniaffiinaruHane是姜科山姜属植物，在中国重要漫衍于广东、海南、台湾、云南和广西(后两省为引种)。高良姜枯燥的根茎是知名的十大南药之一，有一千多年药用汗青，据?中国药典?纪录，高良姜味辛、性热，归脾、胃经，具有温胃散寒、行气止痛和消食的成果1，研究表白高良姜另有普及的药理作用2，在香料消费和水果保鲜上也有应用3，4。恒久的采挖和生态情况粉碎，导致高良姜野生资源骤减，如今重要通过无性生殖的方法举行人工种植。比年来，国际市场对高良姜需求增大，国产高良姜远销中东和西欧，代价呈上升趋势，长处的驱动导致了殽杂品和伪品的出现，影响了治疗结果，扰

3、乱了市场，对高良姜的出口造成了负面影响。通过DNA分子标识表记标帜技能创立高良姜的DNA指纹图谱，以及举行高良姜的分子体系分类、分子进化和遗传多样性研究，可以为高良姜的药材的分子断定和质量操纵，以及高良姜种质资源庇护和开拓提供科学根据，而提取高质量的高良姜基因组DNA是举行下一步研究的条件条件。植物含有富厚的次生代谢物，这些化合物的存在滋扰了基因组DNA的提取，差异的植物含有的次生代谢物不一样，基因组DNA的提取要拥有所差异，重要有TAB法和SDS法两种根本要领，并在此底子上举行改进以得当差异的植物57。本研究按照通例的TAB法8举行改进，比力了4个方案提取高良姜基因组DNA的结果，此中，方案

4、4提取结果较好，DNA纯度和产率较高，可以用于卑劣的分子生物学研究。1质料与要领1.1试剂和溶液TAB，PVP-40，Tris为Genvie分装，-巯基乙醇、RNAseA为siga分装，EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇为国产阐发纯，ER和se为NEB产物，Hindarker和DL2000arker为Takara产物。洗濯缓冲液：200l/LTris-Hl(pH8.0)；50l/LEDTA；250l/LNal；2%PVP-40(/V)提取缓冲液A：2%TAB(/v)；100l/LTris-HlpH8.0；20l/LEDTApH8.0；1.4l/LNal；2%PVP-40(/V)提取缓冲液

5、B：2%TAB(/v)；100l/LTris-HlpH8.0；20l/LEDTApH8.0；4l/LNal；2%PVP-40(/V)提取缓冲液：3%TAB(/v)；100l/LTris-HlpH8.0；20l/LEDTApH8.0；1.4l/LNal；2%PVP-40(/V)10%TAB溶液：10%TAB；0.7l/LNalTE缓冲液：10l/LTrisHlpH8.0；1l/LEDTApH8.0以上溶液都经高压灭菌，备用。1.2仪器115K高速冷冻台式离心机(Siga)，D/U530DNA/PrtEinAnalyzer(Bekan)，del200/210PerSupply(BiRad)，DYP

6、31D型程度电泳槽(北京市六一仪器厂)，hite/UVTransilluinatr凝胶成像仪。1.3质料试验质料采自广东的广州、深圳和徐闻、海南万宁、广西南宁、云南西双版纳等地，颠末中国科学院华南植物研究所邢福武传授断定为植物高良姜A.ffiinaruHane。采摘高良姜顶端嫩叶，剪为约2长的小段，放入装有枯燥硅胶的密封袋中举行快速枯燥，硅胶与叶子的体积比约莫为101，硅胶吸水变色时要调换硅胶，枯燥叶片保存在密封的塑料袋中置于-20保存。1.4提取DNA的步调1.5提取DNA的方案1.6DNA浓度、纯度的测定DNA的浓度ng/lD26050ng/l稀释倍数DNA产率DNA浓度ng/lDNA原液

7、体积l/干叶重量/g2结果与讨论从植物构造中提取DNA必需撤除卵白质、RNA、多糖、多酚等杂质，尤其是多糖和多酚，它们的存在会严峻按捺限定性内切酶和TaqDNA聚合酶的活性9，10，影响后续的研究。DNA的纯度可以从D260/D280比值和D260/D230比值来断定。DNA在260n处有汲取峰，而卵白质在280n处有汲取峰，理论上D260/D2801.8时表现DNA纯洁，D260/D2801.8时表现有卵白质污染，D260/D2801.8时表现有RNA污染，在230n处有汲取表现有多酚和色素污染11。从琼脂糖凝胶电泳结果来看，方案1提取的DNA主亮带清楚且没有显着拖尾征象，但是加样孔较亮图1

8、A，说明DNA较完备，但是多糖没有去除干净。方案2和方案3提取的DNA，未见有DNA亮带图1B，说明DNA含量很低，与分光光度计检测结果同等。方案4提取的DNA主亮带清楚，没有拖尾，加样孔比力干净图1，外貌DNA完备且纯度高。用方案4提取的基因组DNA经ER和se酶切，在1.6%脂糖糖凝胶上条带呈匀称的弥散状条带图2，说明DNA被完全酶切，做AFLP阐发可以或许得到清楚的多态性条带图3，以上结果进一步表白，用方案4提取的DNA纯度较高，切合分子生物学研究的要求。我们用方案4提取了采自广东、海南、广西、云南等地170多份高良姜的基因组DNA，都获得了较好的结果，D260/D280比值在1.82.

9、0的范畴内，D260/D230比值大部门大于1.7，小部门D260/D230比值在1.7以下，大概是由于田野网罗时，用枯燥硅胶处置惩罚样品时没有实时调换，导致叶片褐变，提取DNA的时间很难完全撤除褐变的色素。全部提取的基因组DNA都可以被限定性内切酶完全酶切和举行PR反响，因此以为基因组DNA的纯度都切合研究要求。3结论提取高良姜基因组DNA时应该留意以下事项：幼嫩的叶子DNA含量高而次生代谢物含量低，因此试验质料只管采幼嫩的叶子。用枯燥硅胶处置惩罚叶片时应实时调换变色的硅胶，不然叶片轻易褐变，影响以后DNA的提取和纯化。用液氮研磨叶片时要彻底，研磨完要敏捷转移到离心管中并置碎冰上保持低温。研

10、磨彻底是为了得到较高的DNA产率，敏捷转移是防范样品长时间与气氛打仗导致多酚物质被氧化，保持低温是为了按捺内源DNA酶和多酚氧化酶的作用，防范DNA落解和多酚氧化。在抽提历程中，颠倒混匀溶液的行动不宜太剧烈，以防DNA被剪堵截裂。用氯仿/异戊醇抽提后汲取DNA水相时，防范把中心卵白层吸起来，以免影响DNA纯度。用异丙醇沉淀DNA后，离心转速不宜太大，防范DNA沉淀被压得太实，倒霉于70%和90%的乙醇洗涤扫除无机盐离子等小分子杂质，必需风干DNA沉淀，防范乙醇残留。实行表现用含高浓度TAB和高浓度Nal的提取缓冲液提取高良姜基因组DNA方案2和方案3的结果不抱负，DNA的产率很低，且纯度不切合要求。用液氮研磨叶子后，在细胞核、叶绿体和线粒体的膜布局裂解和DNA开释出来之前，用洗濯缓冲液200l/LTris-Hl(pH8.0)；50l/LEDTA；250l/LNal；2%PVP-40(/V