口腔生物学：第六章 口腔细胞培养及其应用

1、第六章 口腔细胞培养及其应用提要：本章介绍细胞培养的基本原理及基本方法；牙齿相关细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、颌骨相关硬组织细胞、口腔肿瘤细胞的培养及特点；组织工程的基本原理、口腔组织特有的干细胞、再生医学技术在口腔医学中的应用；基因芯片、蛋白芯片、组织芯片，蛋白质组学、生物信息学、模式生物学、系统生物学等。重点掌握细胞培养基本原理及方法，口腔医学中相关细胞培养及其特点，了解口腔干细胞培养在口腔再生医学中的应用及口腔生物学其他研究方法。第一节 细胞培养与cell相关的SCI杂志Cell IF:33.166Stem cell IF: 7.133Blood IF:9.775Molecular a

2、nd cellular biology IF: 5.036Journal of cell biology IF:9.688Cellular microbiology IF:4.816细胞培养(cell culture)也叫细胞克隆技术 ，将真核生物或原核生物细胞培养在受控制的状态下，使其生长。这项技术的发展与方法，与组织培养或器官培养关系密切 。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 细胞培养发展史1885年，Roux温生理盐水培育鸡胚组织1907年，哈里森(Harrison)在无菌条件下用淋巴液作培养基，培

3、养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础1910-1912年，Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法1923年，Carral设计创立了卡氏瓶培养法，极大地推动了当时组织培养研究。1943，Earle、Dulbecco等年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系1951年，Dulbecco等采用胰蛋白酶消化组织培养法1951年，Gey首建人肿瘤细胞Hela细胞系1957年，各种培养瓶、培养基孕育而生。用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cellline)通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞

4、株(clone或cellstrain)1963年，进行了单细胞克隆1975年，Sato成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株CH41982年，Fridenshtein等发现并建立了以贴壁培养法为主要手段的分离扩增方法1957年，各种培养瓶、培养基孕育而生1990年，干细胞分离1992年，小鼠及大鼠神经干细胞1997年，克隆羊多利诞生1998年，人类胚胎干细胞2006年-2007年，成体干细胞一、细胞培养的基本原理第一节 细胞培养的基本原理细胞培养的基本概念细胞培养(cell culture)： 模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能原代培养(

5、primary cell culture)： 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中第一节 细胞培养的基本原理体外细胞生物学形态特点贴壁型细胞 (adherent cells)悬浮型细胞 (suspended cells)生长增殖过程培养细胞生命期培养细胞一代生存期第一节 细胞培养的基本原理贴壁型细胞(adherent cells)必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞第一节 细胞培养的基本原理按照培养细胞的主要形态可分为几大类型：上皮型;成纤维型;游走型;多形型悬浮

6、型细胞 (suspended cells)于悬浮状态下即可生长不需要贴附于支持物表面多见于血液淋巴细胞第一节 细胞培养的基本原理几种常见细胞的形态原代培养神经元细胞 （10）原代培养星形细胞 （10）神经细胞瘤细胞系 （10）N20Y结肠癌细胞系（10）Caco-2第一节 细胞培养的基本原理培养细胞生命期所谓培养细胞生命期，指细胞在培养中持续增殖和生长的时间 细胞全部生存过程大致分为以下三个阶段：原代培养期传代期 衰退期第一节 细胞培养的基本原理原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周 传代期：初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。在全生命期中此期的持

7、续时间最长衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡第一节 细胞培养的基本原理细胞永生性 (Immortalization)也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，成为无限细胞系无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。可能恶性变细胞永生性和恶性性非同一性状第一节 细胞培养的基本原理第一节 细胞培养的基本原理培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，细胞传代后，一般要经过以下三个阶段: 潜伏期（游离期，贴壁期） 对数生长期 停滞期（平台期）第一节 细胞培养的基本原理培养细胞一代生存期第

8、一节 细胞培养的基本原理细胞生长过程中的重要现象接触抑制：由于细胞的相互接触而抑制细胞运动密度抑制：细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而停止生长第一节 细胞培养的基本原理培养细胞的体外生长环境无污染环境基质气体环境和氢离子浓度液相环境温度渗透压第一节 细胞培养的基本原理 无污染环境：高压蒸汽消毒器电热干燥箱滤器超净工作台紫外灯 第一节 细胞培养的基本原理基质：玻璃基质塑料饲养细胞，又称滋养细胞生物性基质处理培养表面金属 第一节 细胞培养的基本原理气体环境和氢离子浓度 ：5%二氧化碳 95%空气 pH为7.27.4 第一节 细胞培养的基本原理液相环境：水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐液 ：Han

9、ks液、PBS、Earle液等天然培养基 合成培养基 无血清培养基 第一节 细胞培养的基本原理温度维持 ：（36.50.5） 渗透压 ：290320 mOsm/kg 第一节 细胞培养的基本原理细胞培养常见仪器超净工作台细胞培养箱倒置相差显微镜第一节 细胞培养的基本原理二、细胞培养的基本方法第一节 细胞培养的基本原理无菌操作中的注意事项对实验中可能用到的器具及培养用液进行严格消毒灭菌 培养室的消毒 ：培养室和超净台要用紫外灯和酒精严格消毒 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)， 紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。 然后紫外线消毒3

10、0min。第一节 细胞培养的基本原理进入无菌室前要按照外科手术无菌要求进行洗手与着装 原则上和外科手术相同。 开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物 品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。培养过程中要注意无菌操作 ：时刻铭记无菌物品与有菌物品要分开处理ABA 超净工作台中的实验用品要摆放整齐B 实验前75%酒精喷洗双手无菌操作技术第一节 细胞培养的基本原理C D 开启封闭瓶口等操作应在火焰就近的地方，并轻轻灼烧CD第一节 细胞培养的基本原理EFE F移液操作第一节 细胞培养的基本原理基本培养操作技术培养细胞的取材与分离 体外培养细胞的纯化 细胞的冻存与复苏 第一节 细胞培

11、养的基本原理培养细胞的取材与分离 取材部位准确 严格无菌操作 尽快培养 减小损伤 制备标本第一节 细胞培养的基本原理细胞培养常用方法：组织块培养法酶消化法第一节 细胞培养的基本原理体外细胞的纯化人工纯化：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法 等自然纯化 第一节 细胞培养的基本原理细胞计数 血球计数板 血细胞计数仪细胞活力测定 台盼蓝染色 流式细胞术细胞冻存 (freezing) 要点：冷冻过程要缓慢冻存细胞必须处在对数生长期细胞复苏(thawing)要点：快速解冻解冻后的细胞应离心去除冷冻保护剂后再接种到培养基中第一节 细胞培养的基本原理细胞培养的污染、检测

12、与控制 微生物污染：细菌，真菌，支原体等污染化学污染：指影响细胞生存的非细胞所需物质混入培养物中 ，应在操作中防止 细胞交叉污染：指目的细胞中混入其他种细胞 ，预防方法主要是严格按照规定操作，做好标记，避免发生混乱 第一节 细胞培养的基本原理微生物污染：污染的途径：空气 、器材 、操作 、试剂 、组织标本 微生物污染的检测 肉眼观察，培养检测，显微镜观察，PCR微生物污染的控制：抗生素除菌法；加温处理 第一节 细胞培养的基本原理FL cell polluted by Staphylococcus FL cell polluted by G+ Bacteria 第一节 细胞培养的基本原理FL c

13、ell polluted by escherichia coli FL cell polluted by mold fungus 第一节 细胞培养的基本原理第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点一、牙齿相关细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点牙周膜细胞 (Periodontal ligament cells)培养方法：组织块法；酶消化法细胞形态特点免疫组织化学染色体外培养细胞的生长增殖特点功能特点牙周膜细胞增殖分化的影响因素第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 细胞形态特点 原代 人牙周膜成纤维细胞（10） 第3代人牙周膜成纤维细胞（10）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 免疫组

14、织化学染色波形丝蛋白染色阳性（10）角蛋白染色阴性（10） 第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点体外培养细胞特点：成功率高于牙髓细胞，达40%80%可在体外长时间存活达412个月可持续传40代以上第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点功能特点分泌功能矿化功能收缩功能再生功能根面吸附等第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点牙周膜细胞增殖分化的影响因素生长因子胰岛素纤维黏连蛋白抗坏血酸羟基磷灰石第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点牙髓细胞 (Dental pulp cells)培养方法：酶消化法；组织块培养法细胞形态特点：成纤维细胞型（与牙周膜细胞类似）免疫组织化学染色：波形丝蛋白（+）；角蛋

15、白（-）体外培养细胞的生长增殖特点功能特点第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点生长增殖特点生长增殖较快可传代至第1520代长时间体外培养可呈复层生长第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点功能特点碱性磷酸酶活性矿化现象对钙调节因子的反应对细胞因子的反应对氢氧化钙、羟基磷灰石盖髓剂的反应第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点二、唾液腺细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点唾液腺细胞形态特点免疫组织化学特点功能特点唾液腺细胞的增殖与分化调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点细胞形态特点腺泡上皮细胞：体外培养的腺泡细胞多呈“铺路石”样排列导管上皮细胞：导管上皮

16、细胞呈多边形肌上皮细胞： 肌上皮细胞呈梭形或星形第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点导管上皮细胞 Duct epithelial cells (HSG cell lines)HSG细胞系（4）HSG细胞系（10）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点A 小型猪腮腺上皮细胞原代培养（10）B 小型猪腮腺上皮细胞alpha淀粉酶免疫组化染色（10）腺泡细胞上皮细胞 Acinus epithelial cells第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点免疫组织化学染色腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、 导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷

17、酸酐酶抗体染色阳性反应肌上皮细胞：肌动蛋白、S-100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点功能特点：分泌腺泡细胞：淀粉酶、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌导管细胞：胶原肌上皮细胞：胶原第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点唾液腺细胞的增殖分化基底潜能干细胞理论单细胞全能干细胞理论双细胞亚全能干细胞理论第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素细胞因子激素细胞外基质 钙离子第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点三、口腔黏膜细胞Oral mucosa epithelial cells第二节 口腔

18、医学中相关细胞培养及其特点口腔黏膜细胞 (Oral mucosa epithelial cells)培养方法：组织块法和酶消化法形态特点：卵圆形、多边形，呈“铺路石”样单层排列免疫组织化学染色：波形丝蛋白阴性，角蛋白阳性功能：分泌大量的胶原蛋白与非胶原蛋白第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点 兔口腔黏膜上皮细胞ABA 无血清培养基培养条件下（10）B 滋养细胞层培养条件下（4）第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点四、颌骨相关的硬组织细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点破骨细胞 (Osteoclasts)形态学特点：体积大，多核组织化学染色：破骨细胞单克隆抗体呈阳性反应，与降钙素反应呈

19、蓝紫色，与抗酒石酸磷酸酶反应呈棕褐色功能：骨吸收功能影响破骨细胞功能的因素： 促进破骨细胞功能：破骨细胞激活因子、甲状旁腺素等 抑制破故细胞功能：-干扰素、降钙素等第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点成骨细胞 (Osteoblasts)形态学特点：不同培养方法所获得的成骨细胞形态各有差异免疫组织化学染色特点：BGP、型胶原、碱性磷酸酶活性功能：成骨作用 调节破骨细胞骨吸收作用第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点软骨细胞 (Chondrocytes)形态学特点：多角形，可形成甲苯胺蓝染色阳性的物质免疫组织化学染色特点：GAG、型和型胶原功能：形成软骨或骨影响软骨细胞功能、分化的因素：激素、细

20、胞因子、机械张力和压力、体外培养环境第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点五、口腔肿瘤细胞第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点口腔鳞癌细胞 (Cells of oral squamous cell carcinoma)细胞系来源：舌鳞状细胞癌标本原代及传代培养生物学特性： 多角形上皮样细胞 核/浆比例高，多核仁 高贴壁率，克隆形成率和软琼脂集落形成率第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点唾液腺肿瘤细胞人黏液表皮样癌MEC-1细胞系：低转移细胞株Mc1、Mc2高转移细胞株Mc3、M3SP4腺样囊腺癌ACC-2、ACC-3细胞系第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点成釉细胞瘤细胞细胞系来源：肿瘤

21、组织原代及传代培养生物学特性：生长增殖缓慢，二倍体细胞型应用：目前已获得永生细胞系AM-1及 hTERT(+)-AM细胞系第二节 口腔医学中相关细胞培养及其特点第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用组织工程的基本原理口腔组织特有的干细胞再生医学技术在口腔医学中的应用第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用组织工程的基本原理 (tissue engineering)种子细胞体外扩增，与生物材料按一定的比例混合，将细胞-材料复合物植入机体的组织或器官的病损部位，以达到修复创伤和重建功能的目的目前组织工程常用的支架材料是合成的可生物降解的高分子聚合物是聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸和聚乙

22、醇酸复合物（PLGA）等第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用口腔组织特有的干细胞 (stem cells)牙髓干细胞牙周膜干细胞脱落乳牙牙髓干细胞根尖牙乳头干细胞唾液腺干细胞 第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用Dental stem cellshuman dental pulp stem cells (DPSCs)stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED)periodontal ligament stem cells (PDLSCs)stem cells from apical papilla (SCAP)stem ce

23、lls from salivary gland牙髓干细胞 (DPSCs)比BMSCS具有更强的增殖率、克隆形成率和倍增率可被诱导分化为脂肪细胞、神经样细胞Stroo-1和CD146等干细胞表面标记阳性体内诱导可形成类似牙本质-牙髓复合体样的结构第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用脱落乳牙牙髓干细胞 (SHED)比BMSSCs具有更强的增殖率、克隆形成率和倍增率Stroo-1和CD146等干细胞表面标记阳性可诱导分化为神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞体外可形成钙化结节内体可在免疫缺陷小鼠皮下成骨和产生牙本质样物质第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用牙周膜干细胞 (PDLSCs)Stro-1和

24、MUC18及腱特异性标记SCX表达阳性可被诱导分化为牙髓母细胞、脂肪细胞、纤维母细胞、牙骨质细胞和成骨细胞体外可形成矿化结节，表达碱性磷酸酶或骨唾液蛋白体内试验牙周膜干细胞能产生沿牙周膜结缔组织方向走行的牙骨质样结构第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用根尖牙乳头干细胞 (SCAP)比牙髓干细胞具有更高的增殖活性CD24是SCAP较特异的表面标志物在体外SCAP可横向分化为成牙本质细胞和脂肪细胞，并能产生比牙髓干细胞更多的牙髓-牙本质复合物第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用唾液腺干细胞 组织定位：导管上皮 停留在腺泡、间质中的前体细胞可诱导分化为表达肝细胞和胰腺内分泌细胞表型体外培养后植入

25、肝脏，可分泌白蛋白第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用再生医学技术在口腔医学中的应用在颌面重建中的作用： 介导颌面部骨及软骨缺损修复在引导口腔组织再生中的作用：促进牙周组织重建组织工程化黏膜在口腔医学中的应用 组织工程用于人造唾液腺牙再生：组织工程方法-种子细胞+支架材料 发育生物学-模拟牙齿发育的过程第三节 细胞培养在口腔再生医学中的应用第四节 口腔生物学其他研究方法口腔生物学其他研究方法基因芯片、蛋白芯片 和组织芯片蛋白质组学生物信息学模式生物学系统生物学第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术 gene microarray基因芯片技术，又称DNA微阵列技术，是将cDNA文库中已知和

26、未知的全长序列或寡核苷酸序列固定于玻片上，同时检测比较生物样品中多个已知或未知序列的表达状况基因芯片技术基本原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息的重要手段第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术的主要技术流程芯片的设计与制备靶基因的标记芯片杂交与杂交信号检测第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术的应用基因表达谱分析新基因发现基因突变及多态性分析基因组文库作图疾病诊断和预测药物筛选基因测序等第四节 口腔生物学其他研究方法基因芯片技术存在的问题设备昂贵，例如制造仪器，现代化的实验平台及激光共聚焦显微镜等，并且制造光刻掩膜需较高费用DNA芯片上原位合成

27、探针难免有错误核苷酸掺入及混入杂质，使整个杂交背景增高，降低特异性第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白芯片技术 protein microarray蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在蛋白水平上检测表达模式在基因表达研究中比基因芯片有着更加直接的应用前景第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白芯片技术主要技术流程Chip membraneHybridizationLabeled protein sampleAdd StreptavidinStreptavidinFluorescent labelingStreptavidin AbAdd f

28、luorescent labelingStreptavidin AbFluorescent detect第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白芯片技术的应用研究疾病的发病机制，协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子探讨作用物与酶相互作用的机制的分析开发新药以及协助蛋白质组的研究第四节 口腔生物学其他研究方法存在的问题固定于载体上的蛋白质结构单一，无法反应蛋白质结构的多样性固定于载体上的蛋白质的稳定性直接影响蛋白芯片的稳定性蛋白芯片造价比较昂贵影响结果特异性的因素较多第四节 口腔生物学其他研究方法组织芯片技术 tissue microarray组织芯片技术是近年来基因芯片技术的发展和延伸它可以将大量临床组织

29、标本排列在一张载体进行分析研究可以最大限度地利用组织资源所需样品少，是一种高通量、多样本的分析工具第四节 口腔生物学其他研究方法应用协助人类基因组学的研究疾病相关基因的验证新药物的开发与筛选治疗过程的追踪和预后等方面的研究第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白质组学 proteomics蛋白质组学的研究对象是特定的时间和特定的空一个完整的生物体（或细胞）所表达的全体蛋白质的特征包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白质与蛋白质相互作用等在蛋白质水平上获得对于有关生物体生理、病理等过程的全面认识第四节 口腔生物学其他研究方法蛋白质组学的研究内容蛋白质鉴定翻译后修饰蛋白质功能确定服务于人类的健康第四节

30、 口腔生物学其他研究方法Intact cell of tissueCell lysisProtein LC2D gelsMixture of proteinsCollect fractionIndividual proteinTrypsin digestionProtein LC profileProtein LC profileMass spectrumMixture of proteinElectrospray of MALDIQuantitative ComparisonsProtein IdentificationMass spectrumProtein LC profile2D gelimageTrypsin digestionExtract spotTrypsin di