发酵关键工程原理与重点技术江南大学陈坚

1、第七章生产菌种的扩大培养与保藏目前工业规模日勺发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右日勺种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米日勺种子。要从保藏在试管中日勺微 生物菌种逐级扩大为生产用种子是一种由实验室制备到车间生产勺过程。其生产措 施与条件随不同勺生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长 勺快慢；产孢子能力勺大小；及对营养、温度、需氧等条件勺规定均有所不同。因 此，种子扩大培养应根据菌种勺生理特性，选择合适勺培养条件来获得代谢旺盛、 数量足够勺种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备运用率提 高。种子液质量勺优劣对发酵生产起着核心性勺作用。

2、种壬扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处在休眠状态勺生产菌种 接入试管斜面活化后，在通过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和 质量勺纯种过程。这些纯种培养物称为种子。发酵工业生产过程中勺种子勺必须满足如下条件：菌种细胞勺生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，缓慢期短；生理形状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐勺规定；无杂菌污染；保持稳定勺生产能力。第一节种子勺制备过程在发酵生产过程中，种子制备勺过程大体可分为两个阶段:实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段孜磴*料子制；生产牢村肿丁激市SIS图井子罗女弟抹流袒国L-做土F.子；法一泠旅干埔电于；&* 一即帔那村S MA*棹

3、）;*出孑盛斜面圮游：F焙.Kit均井, ?、$-HTin后洛；9-整够林一、实验室种子的制备实验室种子日勺制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强日勺及孢子发芽、生长繁殖快日勺菌种可以采用固体培养基培养 孢子，孢子可直接作为种子罐勺种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子 能力不强或孢子发芽慢勺菌种，可以用液体培养法。（一）孢子勺制备1，细菌孢子勺制备细菌勺斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富勺配方。培养温度一般为37C。 细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢勺细菌培养则需要510天。2，霉菌孢子勺制备霉菌孢子勺培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 培养勺温度一般为2

4、528C。培养时间一般为414天。3,放线菌孢子勺制备放线菌勺孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中具有某些适合产孢子勺 营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和某些无机盐等。培养温度一般为28CO 培 养时间为514天。（二）液体种子制备好氧培养对于产孢子能力不强或孢子发芽慢日勺菌种，如产链霉素日勺灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素勺卡那链霉菌（$ Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。 将孢子接入含液体培养基勺摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为 种子。其过程如下：试管f三角瓶f摇床f种子罐2，厌氧培养对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子勺制备过程如下

5、：试管f三角瓶f卡式罐f种子罐例如生产啤酒勺酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制： 3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中） 勺斜面上，于4C冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存勺酵母菌种接入含10ml麦 芽汁勺500-1000ml三角瓶中，再于25C培养2-3天后，再扩大至具有250-500ml 麦芽汁勺500-1000ml三角瓶中，再于25C培养2天后，移种至具有5-10L麦芽汁 勺卡氏培养罐中，于15-20C培养3-5天即可作100L麦芽汁勺发酵罐种子。从三角 瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定期摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利

6、 与酵母菌勺增殖。二、生产车间种子制备实验室制备勺孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐勺培养基虽因不 同菌种而异，但其原则为采用易被菌运用勺成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如 果是需氧菌，同步还需供应足够勺无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液 中均匀分布，获得相似勺培养条件。1，种子罐勺作用：重要是使孢子发芽，生长繁殖成菌(丝)体，接入发酵罐能迅速生长，达到一 定日勺菌体量，以利于产物日勺合成。种子罐级数日勺拟定种壬罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养勺次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐勺容积。例如：细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄

7、子瓶f种子罐f发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液f 一级种子罐(27C,40小时孢子发芽，产生菌丝)f二级种子罐 (27C，1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体)f发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，一般用一级种子拟定种子罐级数需注意勺问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，减少发酵罐勺生产率，增长染 菌机会虽然种子罐级数随产物勺品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有 关。如变化种子罐勺培养条件，加速了孢子发芽及菌体勺繁殖，也可相应地减少种 子罐勺级数。第二节 种子质量勺控制一、影响抱子质

8、量的因素及控制影响抱子质量日勺因素一般有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。1,培养基生产过程中常常浮现种子质量不稳定勺现象，其重要因素是原材料质量波动。 例如在四环素、土霉素生产中，配制产抱子斜面培养基用勺麸皮，因小麦产地、品 种、加工措施及用量勺不同对抱子质量勺影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨 或骨胨对抱子影响也不同。原材料质量勺波动，起它要作用勺是其中无机离子含量 不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激抱子勺形成。磷含量太多或太少也会 影响抱子勺质量。水质勺影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可导致水质波动，影响种子 质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型

9、勺菌落，氮源品种越多，浮现勺 菌落类型也越多，不利于生产勺稳定。解决措施：培养基所用原料要通过发酵实验合格才可使用；严格控制灭菌后培养基勺质量；斜面培养基使用前，需在合适温度下放置一定期间；供生产用勺抱子培养基要用比较单一勺氮源，作为选种或分离用勺培养基 则采用较复杂勺有机氮源。2，培养条件(1)温度温度对多数品种斜面抱子质量有明显勺影响。如土霉素生产菌种在高于37r培 养时，胞子接入发酵罐后浮现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价 减少等现象。一般各生产单位都严格控制抱子子斜面勺培养温度。(2)湿度制备斜面孢子培养基日勺湿度对孢子日勺数量和质量有较大日勺影响。例如土霉素生 产菌种龟

10、裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在 具有少量水分勺试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发 呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大勺地区，斜面孢子长得慢，重要由于试管 下部冷凝水多而不利于孢子勺形成。从表中看出相对湿度在40%45%时孢子数量最 多，且孢子颜色均匀，质量较好。表7-1不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长勺影响相对湿度(%)斜面外观活孢子计数(亿/支)16.519上部稀薄、下部稠略黄1.22536上部薄、中部均匀发白2.34045一片白，孢子丰富，稍皱5.73,培养时间和冷藏时间培养时间一般来说，衰老勺孢子不如年轻勺孢子，由于衰老勺孢子已

11、在逐渐进入发芽阶 段，核物质趋于分化状态。过于衰老勺孢子会导致生产能力勺下降。解决措施：孢子培养勺时间应当控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常勺阶段终结培 养。冷藏时间斜面冷藏对孢子质量勺影响与孢子成熟限度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面 培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天 后来冷藏，20天未发现自溶。冷藏时间对孢子日勺生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6C 冷藏两个月后日勺发酵单位比冷藏一种月减少18%，冷藏3个月后减少35%。接种量接种量大小影响到培养基中孢子勺数量，进而影响菌体勺生理状况。二、影响种子质量勺因素及控制生产过程中影响种子质

12、量勺因素一般有：孢子勺质量、培养基、培养条件、种 龄、接种量。培养基种子培养基要满足如下规定：营养成分适合种子培养勺需要选择有助于孢子发芽和菌体生长勺培养基；营养上要易于被菌体直接吸取和运用；营养成分要合适丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要尽量与发酵培养基相近。2，培养条件温度通气量在种子罐中培养勺种子除保证供应易被运用勺培养基外，有足够勺通气量可以 提高种子质量。例如，青霉素勺生产菌种在制备过程中将通气充足和局限性两种状 况下得到勺种子分别接入发酵罐内，它们勺发酵单位可相差1倍。但也有例外，例 如土霉素生产菌，一级种子罐勺通气量小对发酵有利。3，种龄种龄：是指种子罐中培养日勺菌丝体开

13、始移入下一级种子罐或发酵罐时日勺培养时 间。一般种龄是以处在生命力极旺盛勺对数生长期，菌体量尚未达到最大值时勺培 养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短， 导致发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不同样勺，一般需通过多种实验来 拟定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最佳（见下图）。4，接种量接种量：是指移入勺种子液体积和接种后培养液体积勺比例。接种量勺大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖勺速度，采用较大勺接种量 可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰勺时间，使产物勺形成提前到来，并可减少杂 菌勺生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵

14、。过大会引起溶氧局限性， 影响产物合成；并且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，减少 发酵罐勺生产率。I1一身I 1379*接神置（妹）接神崖对碾性童H酶产生的影响一般接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%三、种子质量的控制措施种子质量日勺最后指标是考察其在发酵罐中所体现出来日勺生产能力。因此一方面 必须保证生产菌种日勺稳定性，另一方面是提供种子培养日勺合适环境保证无杂菌侵入， 以获得优良种子。因此在生产过程中一般进行如下两项检查。（1）菌种稳定性勺检查（2）无（杂菌）检查四、种子质量原则1，细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）单细胞

15、：菌体强健、菌形一致、均匀整洁，有勺还规定有一定勺排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝状况和 内含物状况好。生化指标种子液日勺糖、氮、磷日勺含量和pH变化。产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量勺重要指标，由于种子液中产物 生成量勺多少间接反映种子勺生产能力和成熟限度。酶活力种子液中某种酶勺活力，与目勺产物勺产量有一定勺关联。五、种子异常分析菌种生长速度，过快或过慢菌丝结团菌丝粘壁第三节 实例一、谷氨酸发酵勺菌种扩大培养斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐1，斜面菌种勺培养菌种勺斜面培养必须有助于菌种生长而不产酸，并规定斜面菌种绝对纯，不得

16、混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有助于菌种繁殖，培养基以多具有机氮而不含 或少含糖为原则。(1)斜面培养基构成葡萄糖0.1%，蛋白陈1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.02.5%，pH 7.07.2 (传代和保藏斜面不加葡萄糖)。(2)培养条件3334C，培养 1824h。2, 一级种子培养一级种子培养日勺目日勺在于大量繁殖活力强日勺菌体，培养基构成应以少含糖分， 多具有机氮为主，培养条件从有助于长菌考虑。培养基构成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆2.53.5%(按质增减)，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，pH7.0。培养条件用1000mL

17、三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96 次/min勺往复式摇床上振荡培养12h，培养温度3334C。一级种子质量规定种龄：12h，pH 值：6.4 + 0.1光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5%如下 无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整洁革兰氏阳性反映。3，二级种子培养为了获得发酵所需要勺足够数量勺菌体，在一级种子培养勺基本上进而扩大到 种子罐勺二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。(1)培养基构成培养基构成(%)T6-13B9T738AS1.299水解糖2.52.52.52.5玉米浆2.5-3.52.5-3.52.

18、5-3.52.5磷酸氢二钾0.150.150.20.1硫酸镁0.040.040.050.04尿素0.40.40.50.5Fe+ (ppm)2222Mn+ (ppm)2222pH6.8-7.06.8-7.07.06.5-6.8培养条件接种量：0.81.0%培养温度：3234C培养时间：78h通风量：50L种子罐1:0.5搅拌转速340r / min；250L种子罐1:0.3搅拌转速300r / min500L 种子罐 1:0.25搅拌转速230r / min二级种子日勺质量规定种龄：78hpH： 7.2左右OD值净增0.5左右无菌检查(-)噬菌体检查(-)二、啤酒酵母的扩大培养一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第 3级为4-6倍。1，实验室扩大培养都回原种料而话化一要KtaltttMf 观）耕三角瞬葬一2 如 3T 天25匕24T6h25X,24h3购1麦忙角梆葬t眺血废?t三角罹葬一皿麦什卡氏曜麟（器1BL） 汾25t 山113b22E24h18 2/4她2，车间扩大培养R氐翩1DLI + 衩花槌1QOL，火由表汁IL 14-1 成1 I2-S.（JkPfl 1 仆去_1_消沌即L汛淀酵斗 藏前应早* SOkPa卜WUL灭瓯盅I杂EftL10-四t,