雌二醇的免疫胶体金试纸法检测

1、雌二醇的免疫胶体金试纸法检测【关键词】雌二醇雌二醇(17-Estradil)是自然雌激素的紧张身分，为防范儿童性早熟等题目，食品中尤其是畜禽产物的雌二醇检测不容无视。胶体金免疫层析技能(GIA)在检测小分子有机物方面越来越受到器重。其根本原理是胶体金颗粒可以或许稳定吸附卵白质，而卵白质的生物活性无显着变革，以是它可以代替酶标识表记标帜抗体1，2。本实行接纳标识表记标帜有雌二醇单克隆抗体的胶体金颗粒与相对应的结实在硝酸纤维膜上的雌二醇结合物相结合，结实有雌二醇结合物的检测线处就显现显着的颜色3，4。本法具有敏捷度高、特异性强、轻便快速、本钱较低、结果轻易判读等长处，实用于样品的开端筛眩1质料与要

2、领11试剂与仪器氯金酸(上海化学试剂厂)；牛血明净卵白、卵明净卵白、兔抗鼠多抗(天津联星生物公司)；雌二醇尺度品、雌二醇单抗、17-Estradil-6-ne6-(-arbxyethvyxie)美国Siga公司)；其他试剂均为国产阐发纯。硝酸纤维膜、玻璃纤维膜美国illipre公司)；BekanDu530分光光度计(德国Bekan公司)；低温高速离心机(军事医学科学院；点膜机(美国Bi-Dt公司)。12要领121胶体金的制备用三蒸水溶解氯金酸，使其终浓度为01gL。先举行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100l参加1柠檬酸三钠25l，再沸水浴下快速搅拌，直到氯金酸溶液的颜色稳定，继承沸水浴10i

3、n5，冷却至室温后，用透射电镜镜检并用分光光度计检测颗粒匀称度及粒度。末了置于4冰箱保存备用。122最适标识表记标帜卵白量简直定用02lLK23将胶体金溶液调至pH为82，然后取试管9支，别离参加10l胶体金溶液。将雌二醇抗体逐级稀释后，各取等体积稀释液挨次参加上述试管中，混匀，另设一不加抗体的比拟管。安排10in，在各管中参加01l的10Nal，混匀后静置2h。不雅察各管中胶体金溶液变革，未加卵白及参加量不敷的溶液颜色由红变蓝，而参加卵白量到达或凌驾时的溶液那么保持稳定。标识表记标帜卵白量即为最低稳定胶体金溶液稳定色的卵白量底子上再加20。123胶体金探针的标识表记标帜将抗体用0005lNa

4、l溶液透析留宿，离心撤除卵白沉淀，调至05gl。取胶体金100l，用0，2lLK23将胶体金溶液调至pH为90，磁力快速搅拌下迟钝参加24l稀释的雌二醇抗体，继承搅拌10in，参加牛血明净卵白(BSA)，使其终极浓度为1，再搅拌10in。将开端制得的胶体金探针以4000r离心20in；弃沉淀，上清以10000rin离心60in；弃上清，沉淀用001lL的磷酸盐缓冲液(PBS)(含1牛血明净卵白)重新悬浮；同前离心洗涤2次，将沉淀用001lL的PBS(pH82，含1BSA，002NaN3)悬浮，4保存备用。124抗原的合成小分子物质难以结实在硝酸纤维膜上，只有使它连上大分子物质才气较好地结实。本

5、实行接纳混淆酸酐法制备完全抗原。雌二醇-6-肟43g,参加三正丁胺50l,二氧六环4l，冰浴冷却到10以下，参加氯甲酸乙酯15l6。410下反响30in。配制卵明净卵白(VA)溶液(VA10g，3l水，3l二氧六环，1lL氢氧化钠03l)。将配制好的VA溶液参加反响液，4冰浴搅拌6h，反响历程中，用氢氧化钠维持pH值为8。反响完毕后，将反响液参加透析袋，透析2d。将透析液调至pH45，冰箱4，安排4天，有黄色沉淀出现。离心网络沉淀，冷冻枯燥，4冰箱保存。将VA溶于透析液内作为参比，用紫外光谱法对雌二醇-6肟-VA举行定性查验。经紫外测定证实卵白质已与雌二醇衍生物结合。125胶体金免疫层析试纸条

6、制备测试条由玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、加样纸、吸水纸4部门构成。将玻璃纤维膜裁成6的细条，然后放入含1BSA、1Teen-20的PB液中浸泡30in，37烘干，末了将胶体金探针灌注已处置惩罚好的玻璃纤维膜上，真空枯燥备用。在硝酸纤维膜上用点膜机将上述抗原和兔抗鼠IgG喷成2条线，别离为检测线和比拟线，经真空枯燥后，用1BSA、001lLPBSpH90)关闭2h，以001lLPBS洗涤，再真空枯燥。将30吸水纸、25硝酸纤维膜、6玻璃纤维膜、15加样纸，由顶部依次粘于PV板上，裁成细条备用。126检测与判读样品：含浓度雌二醇样品的乙醇溶液分为3组，第1组不加雌二醇，第2组为02gl雌二醇，第3组为

7、04gl雌二醇。将加样纸一端插入待测液，潮湿后取出，程度安排，约35in，不雅察结果。如试纸条硝酸纤维膜上仅比拟线呈一条紫赤色带为阳性；如出现2条紫赤色带为阴性；如质控线不出现紫赤色带，无论检测线是否出现，测试结果均无效。2结果与阐发21胶体金颗粒巨细选择胶体金颗粒吸附卵白并表现检测结果，其巨细是紧张影响因素之一。胶体金颗粒的巨细，由制备胶体金时参加的柠檬酸三钠量决定，当柠檬酸三钠参加越多，胶体金颗粒也越多，但颗粒直径越小，反之胶体金颗粒越大。胶体金颗粒小，结合卵白量少，反响结合率低，别的难以表现豁亮清楚的颜色，影响显色结果；胶体金颗粒大，其结合卵白后不稳定，不易保存，别的其结合卵白后难以通过

8、膜7。本实行选用的胶体金颗粒直径约为15in，既可以通过膜，反响彻底，又易保存，反响结果显色清楚。22胶体金颗粒断定胶体金颗粒巨细及均一程度是检测结果可靠的底子，制备完毕后须经质量断定才气应用。用BekanDu530分光光度计对胶体金举行扫描，创造其主峰宽度较小，表白制备的胶体金颗粒较匀称，ax为520n(图1)，表白其粒度约为15n8。用电镜不雅测结果(图2)与分光光度计测定结果同等。电镜不雅测是断定胶体金颗粒粒径及漫衍的尺度，但这种要领未便用于一样平常事情利用，而用分光光度计测定操纵轻便，更得当实行室一样平常利用。图1胶体金的可见光谱图略23最适卵白量阴性比拟为未加抗体管，17管抗体浓度别

9、离为10,12,14,16,18,20,22gl,阳性比拟为胶体金溶液。可见，本实行最适标识表记标帜卵白量为20gl(图3)。24E2-VA浓度用PBS(pH74)溶解E2-VA浓度为00510gl,喷在硝酸纤维膜上作检测线，创造E2-VA浓度越高，检测液中也必要越高浓度的E2与之竞争，检测敏捷度也就越低。但是，E2-VA浓度低于05gl，检测线颜色太弱，难用肉眼区分。图2胶体金电镜图略阴性比拟为未加抗体管；阳性比拟为胶体金溶液图3胶体金与雌二醇抗体结合浓度确定实行略25检测限本实行的检测限是以完全看不见检测线为最低检测限9。将雌二醇尺度品用甲醇配制成04，02，01，005gl4个尺度溶液，

10、用上述检测要领举行检测(图4)。由图可见，最低检测线为100ng/l。图4试纸条检测样品略26比拟实行取30份样品，检测分为3组，第1组不加雌二醇，第2组加02gl雌二醇，第3组加04gl雌二醇，别离用GIA法与气质联用法(GS)检测。实行结果表现，第1组2种要领均未检出；第2组GIA法阳性9粒，阴性1粒，GS法阳性10粒；第3组2种要领均检测阳性。由此可见，与尺度检测要领比拟，GIA法正确度为9667。27交织反响试验实行结果表现，与己烯雌酚、炔雌酚、壬基酚、阿特拉津及双酚A等情况内排泄滋扰物中的情况雌激素无交织反响，表白该要领具有精良的特异性。3小结如今，关于雌二醇的检测有气、液相色谱和光

11、谱、质谱等要领，但其仪器昂贵、操纵庞大、检测时间较长。本文创立的免疫胶体金层析法具有敏捷度高、特异性强、轻便快速、本钱较低、结果轻易判读等长处，且无需任何仪器，操纵简朴，实用于样品的开端筛眩参考文献1DykanLA，BgatyrevVA.llidalgldinslidphaseassaysJ.Biheistry(s),1997,62:350-356.2HayatA.InllidalGld:Priniples,ethdsandAppliatins;AadeiPress.SanDiegAvadPress,1989:15-19.3HrtnJK,SinburneS,SullivanJ.Anvelrap

12、id,single-stepiunhratgraphipredurefrthedetetinfuseiunglbulinJJ.Iunlethds,1991,140:131-134.4Dequaire,Degrand,LagesB.Aneletrheial,etalliunassaybasednallidalgldlabelJ.Analhe,2000,72:5521-5528.5Hrisberger,RssetJ.llidalgld,ausefularkerfrtransissinandsanningeletrnirspyJJ.Histheythe,1997,25(4):295.6姜玲，章文才，柯云,等.抗槲皮素抗体的研制J.中国免疫学杂志，2000，16(5)：383-385.7DengYP,ZhaHQ,JiangL,AppliatinsfnangldpartilesinbiietiengineeringJ.