国家自然基金重点项目答辩

1、项目名称：IRF家族乙酰化修饰在心脏重构中的作用及机制研究项目申请人： 项目申报单位： 武汉大学项目合作申请单位：香港理工大学汇报提纲of236一、项目科学问题的提出与立项意义二、项目的研究内容与研究目标三、项目的研究方案四、项目的可行性与创新点五、工作基础我国心血管疾病现状1/10万其他疾病肿瘤呼吸系统疾病心血管疾病41%13%22%25%25012010860心血管疾病死亡率心血管疾病死因构成比中国心血管报告2011心血管疾病死亡率及死因构成比均居各种疾病之首of336立项意义心力衰竭是多种心血管疾病的终点瓣膜病心肌炎冠心病高血压心肌病心脏重构心脏重构是心力衰竭发生发展的基本机制心力衰竭o

2、f436立项意义心脏重构正常心脏心脏重构心力衰竭病理性刺激细胞膜受体蛋白质合成细胞死亡心肌纤维化细胞大小信号通路MAPKsPI3K-AKTCalcineurinNF-BAMPKPKC依靠蛋白质的修饰将胞外信号传递至胞内并逐级放大细胞膜？of536立项意义蛋白质甲基化磷酸化泛素化乙酰化Glu, His, Lys, ArgSer, Thr, TyrLysTyr, Lys蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质构象改变、活性改变、稳定性改变蛋白质翻译后修饰ACACCH3PCH3UbUbP调节蛋白质的生物学功能of636立项意义调节蛋白质稳定性HDACiHDACs蛋白质HATsHDAC4/5/6/7/9/10去乙酰化

3、酶 (HDACs) SIRT1/2/3/45/6/7HDAC11HDAC1/2/3/8乙酰转移酶(HATs)P300/CBPPCAF蛋白质的乙酰化修饰ACACAC蛋白质蛋白质影响蛋白质相互作用调节蛋白质活性蛋白质乙酰化修饰影响蛋白的生物学活性of736立项意义MOZ乙酰化与心脏重构 HDAC1/2/3能促进缺氧诱导的心肺重塑 (Circ Res.2012;110:739-748) HDAC的抑制剂能通过抑制自噬从而抑制心肌肥厚 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:4123-8) HDAC的抑制剂能抑制小鼠缺血再灌注损伤 (FASEB J.2008;22:35

4、49-60) HDAC2通过调节GSK3的活性从而调节心肌肥厚 (Nat Med.2007,13,324-331) 转录辅激活蛋白CAMTA2通过抑制二类HDAC导致 心肌肥厚 (Cell.2006;125 :453466) 一类和二类HDAC能促进压力负荷诱导的心肌肥厚 (Circulation.2006;113:2579-2588) 乙酰转移酶P300能促进心肌梗死后左室重构 (Circulation. 2006;113:679-90) HDAC9能通过抑制MEF2的活性从而抑制心肌肥厚 (Cell.2002;110:479-88) Normal heartFailing heart？ 下

5、游靶基因？Ca2+IP3Ca2+GqPLCPKCPKDPPICOTClass IIa HDAC4,5,7,9Class IIa HDAC4PCaMKIIGsACPKAMEF2CAMTANkx2-5MyocardinSRFMrjNFATCardiac growth and remodeling genes Nucleus-AR-AR/ATIR/ETIRof836立项意义W W W W WDBDIAD2W W W W WIAD2W W W W WIAD1W W W W WIAD1W W W W WIAD1W W W W WIAD1W W W W WIAD1W W W W WIAD1W W W W

6、WIAD1W W W W WIAD1CNCNCNCNCNCNCNCNCNCNIRF1IRF2IRF8IRF7IRF9IRF3IRF4IRF5IRF6IRF10325 aa349 aa427 aa451 aa498 aa467 aa503 aa426 aa393 aa416 aaIRFs是一类转录因子，已发现10个成员（人和小鼠表达IRF1-9、仅鸡表达IRF10）结构N端DNA结合结构域(DBD)结合干扰素刺激反应元件(ISRE)2. C端IRF相关结构域(IAD)与辅助因子结合，调节基因转录功能1. 调控IFN表达2. 调节免疫应答、信号转导 细胞凋亡和肿瘤形成3. 调节免疫细胞的发育、分化

7、、成熟及功能干扰素调节因子 (IRF)of936立项意义IRF的蛋白质修饰机制IRFs的活化受多种转录后修饰机制的调控，包括磷酸化、泛素化、乙酰化修饰磷酸化修饰是目前IRF研究较为成熟的一种修饰方式乙酰化修饰对IRF的激活具有关键的意义IRF1: Lys78IRF2: Lys75, Lys78IRF7: Lys92IRF9: Lys81 degradationIRFPartnerSignal dependent modificationsP300/CBPGCN5/PCAFBAF complexesChromatin modifiersDynamic protein-protein-DNA in

8、teractionPartnerIRFIRFIRFPartnerPartnerof1036IRF乙酰化与心脏重构ABAcety-IRF2IRF2Acety-IRF7IRF7Acety-IRF9IRF939kDa39kDa54kDa54kDa44kDa44kDaPBSAng IIPEISORelative Protein LevelsAcety-IRF2Acety-IRF7Acety-IRF9CD39kDa39kDa54kDa54kDa44kDa44kDaAcety-IRF2IRF2Acety-IRF7IRF7Acety-IRF9IRF9ShamAB 4WAB 8WRelative Protei

9、n LevelsAcety-IRF2Acety-IRF7Acety-IRF9of1136立项意义心脏重构时IRF2/7/9的乙酰化水平显著增加，而IRF1/3/4/5/6/8的变化不显著关键科学问题在心脏重构中IRF2/7/9乙酰化的调控机制及其对心脏重构的影响of1236研究目标 以IRF2/7/9乙酰化为核心，运用原代培养心肌细胞、基因工程大小鼠建立心脏重构疾病模型，鉴定IRF2/7/9乙酰化位点，阐明IRF2/7/9乙酰化的调控机制, 明确其对心脏重构的影响及其机制，为临床干预心脏重构提供新靶点和新依据of1336研究内容研究内容一：鉴定IRF2/7/9乙酰化位点研究内容二：阐明IRF2

10、/7/9乙酰化的调控机制研究内容三：明确IRF2/7/9乙酰化对心脏重构的影 响及其机制研究内容四：IRF2/7/9乙酰化作为干预靶点的评估of1436研究内容一明确心脏重构时IRF2/7/9乙酰化位点原代心肌细胞野生型大小鼠Ang II,PE,ISO诱导主动脉缩窄手术心肌细胞肥大模型动物心肌肥厚模型液相色谱串联气相质谱发现IRF2/7/9乙酰化位点包含IRF2/7/9乙酰化位点多肽的合成完全弗氏佐剂不完全弗氏佐剂免疫新西兰兔ELISA/WB/免疫荧光等鉴定免疫血清纯化血清获得抗体证实IRF2/7/9在相应位点被乙酰化免疫沉淀获取IRF2/7/9of1536研究内容二构建心脏特异性HATs，H

11、DACs敲除和转基因载体获得基因工程动物并建立心肌肥厚模型腺病毒感染并建立原代大鼠心肌细胞肥大模型构建相关HATs，HDACs干扰和过表达腺病毒载体HATs，HDACs蛋白水平和酶活性的检测确定IRF2/7/9的上游的HATs和HDACs动物心肌肥厚模型心肌细胞肥大模型野生型大小鼠原代心肌细胞AngII/PE/ISO诱导 主动脉缩窄手术 用相应抗体检测IRF2/7/9乙酰化水平的变化阐明心脏重构时IRF2/7/9乙酰化的调控机制of1636研究内容三IRF2/7/9乙酰化位点构建单或多个位点K R突变载体原代培养心肌细胞细胞肥大表型评价Ang II/PE/ISO明确对心肌细胞肥大有作用的IRF

12、2/7/9乙酰化位点细胞肥大Marker基因蛋白质合成检测细胞面积检测包装腺病毒构建单或多个位点K Q突变载体病毒活性检测有效的IRF2/7/9乙酰化位点构建心脏特异K R突变knockin载体基因工程动物心肌肥厚表型评价主动脉缩窄术动物水平验证IRF2/7/9乙酰化对心脏重构的影响心肌肥厚Marker基因病理学检测超声心动图检测胚胎显微注射构建心脏特异K Q突变knockin载体血流动力学检测基因芯片RNA sequencingChIP sequencing阐明IRF乙酰化对心脏重构的影响及其机制逆转或挽救实验Mapping鉴定与靶蛋白的相互作用结构域Co-IP鉴定与靶蛋白的相互作用靶蛋白相

13、关信号通路检测of1736研究内容四IRF2/7/9乙酰化作为干预靶点的评估IRF2/7/9乙酰化研发IRF2/7/9乙酰化特异性的抑制剂或激动剂干预调控IRF2/7/9乙酰化的HATs和HDACs心脏重构预防靶点治疗靶点of1836创新点鉴定IRF2/7/9在心脏重构中关键的乙酰化位点，阐明 IRF2/7/9乙酰化的机制，为IRF的翻译后修饰提供新 的理论依据2. 明确IRF2/7/9乙酰化对心脏重构的影响及其分子机制， 为理解心脏重构的发生机制提供新的理论基础3. 发现干预心脏重构的新靶点，为心脏重构的临床防治 提供新思路和新策略 of1936心脏重构发现心脏重构分子靶点阐明心脏重构分子机

14、理IRFs研究探索IRFs在重大疾病中的作用及相关分子机制动物模型研发基因工程动物模型提供疾病研究动物平台工作基础of2036拥有完善的心脏研究平台及分析设备已建立标准的心脏重构的疾病动物模型100多种心脏特异性转基因小鼠及基因敲除小鼠模型以通讯作者或第一作者发表心脏重构方向SCI论文24篇， IF5为17篇，包括Circulation、Circ Res、PNAS、Hypertension、Cardiovasc Res、Basic Res Cardiol等心脏重构为心脏重构领域的研究提供坚实的基础of2136工作基础心肌肥厚心肌梗死心肌炎冠心病脑缺血损伤阿尔兹海默帕金森综合症型糖尿病型糖尿病动

15、脉粥样硬化血管损伤疾病动脉瘤的形成Interferon Regulatory FactorIRF序列研究进展心脏疾病代谢性疾病血管性疾病神经性疾病为IRF在心脏重构领域的研究提供理论依据of2236工作基础IRF3与心脏重构(Published in Basic Res Cardiol)IRF3通过抑制ERK2的激活从而抑制心脏重构的发生发展P-ERK2(Thr188)Lamin B142/44KDa67KDaShamIRF3+/+IRF3-/-IRF3+/+IRF3-/-Aortic BandingCShamAortic BandingP-ERK2/Lamin B1A50M ISO IRF3

16、+/+ IRF3-/- NTG TGCell Surface Area (Fold Change)*01234PBS ISO# NTG TG#*0123456Cell Surface Area (Fold Change)PBS ISO IRF3+/+ IRF3-/-BAB (4 Weeks)Sham (4 Weeks) IRF3+/+ IRF3-/- IRF3+/+ IRF3-/-Whole heartsHW/BW(mg/g)ShamAB IRF3+/+ IRF3-/-HW/TL(mg/mm)ShamAB IRF3+/+ IRF3-/-of2336工作基础IRF4与心脏重构(Published

17、 in Hypertension)IRF4通过激活CREB的表达从而促进心脏重构的发生发展BIRF4+/+IRF4-/-AB (8 weeks)WGA NTG TGAB (4 weeks)HW/BW(mg/g)ShamABHW/BW(mg/g)ShamABAAng IIPBSCSA(m2)Ang IIPBSCSA(m2)AdshRNAAdshIRF4AdGFPAdIRF4Ang II (48 hours)CP-CREBT-CREBProtein/GAPDHP-CREBT-CREBProtein/GAPDHP-CREBT-CREBGAPDHABIRF4+/+IRF4-/-ABNTGTGP-CRE

18、BT-CREBGAPDH NTG TG IRF4+/+ IRF4-/-of2436工作基础IRF7与心脏重构 (Accepted by Circ Res)IRF7通过抑制IKK-NFB信号通路从而抑制心脏重构的发生发展AIRF7+/+IRF7-/-IRF7+/+IRF7-/-Sham (2 Weeks)AB (2 Weeks)WGARelative mRNA LevelsANPBNP-MHCShamABShamABShamABBLVEDd (mm)ShamABLVESd (mm)ShamABFS (%)ShamAB NTG TGSham (8 Weeks) NTG TGAB (8 Weeks)H&ECP-IBser32/36IRF7+/+IRF7-/-Sham (2 Weeks)AB (2 Weeks)IRF7+/+IRF7-/-39kDa39kDa87kDa87kDa36kDaP-IKKser181IBT-IKKGAPDHProtein/GAPDHp-IKK p-IBIBShamAB