现代微生物生态学

1、关于现代微生物生态学第一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月现代生态学的研究领域现代生态学要回答和解决的主要问题微生物生态系统多样性微生物生态学研究方法传统方法分子生物学方法微生物酶活性测定第二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月1现代生态学的研究领域生态系统中种群规模的调控生物生产力的利用和保护研究人工生物群落的稳定性和提高生产力环境污染防治城市生态系统生态学和人类生态学的研究和建设第三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月2现代生态学要研究与解决的主要问题能源短缺问题环境污染问题防止自然生态系统的萎缩、保护森林，防止沙漠化等城市有机废弃物的处理及综合利用的生态工程建立高产高

2、效、持续发展的生态农业和企业化生态工厂。如：白色农业生命活动密切相关元素、化合物及生态效应与人体健康关系。海洋资源的生态调查、开发利用、保护的研究第四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月3微生物生态系统多样性陆生微生物生态系统水生微生物生态系统大气微生物生态系统根系微生物生态系统肠道(消化道)微生物生态系统极端环境微生物生态系统活性污泥微生物生态系统“生物膜”微生物生态系统第五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋古菌的分布海洋真细菌的分布海洋真菌的分布海洋真核微藻的分布海洋病毒的分布海洋微生物的分布第六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋古菌的分布古菌的绝对数量大约占

3、微型浮游生物的2%。表层海水中多为广域古菌，而在150米深以下的水域中则以泉古菌为主。浮游古菌的分布还受到季节、海水温度和海流等环境因素影响。不同海域、不同深度的沉积物中古菌分布不均。同一海域沉积物中，影响古菌分布的主要因素是有机物。海底火山口主要分布为泉古菌，少量为广古菌。海底热泉口主要分布嗜热古菌（典型类群为热网菌属Pyrodictium和火叶菌属Pyrolobus）。海洋浮游古菌沉积物中古菌特殊生境古菌第七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月大多数古菌难以分离培养，主要利用分子生物学技术进行多样性研究。近几年在沿岸水域发现海洋古菌群和海洋古菌群，在不透光层以下海域发现海洋古菌群，在

4、深海海水中发现海洋古菌群。泉古菌目广古菌目第八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月The marine sponge Axinella mexicana and its archaeal symbiont, Cenarchaeum symbiosum. 3A., Axinella mexicana a bright red demosponge found off the California coast. 3C., FISH experiment showing C.symbiosum population present in the s

5、ponge tissues (in green). Many of the C. symbiosum cells are visibly dividing.第十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋真细菌的分布海洋浮游细菌分布受可利用有机物、季节、深度、盐度、及叶绿素浓度影响较大而区域性差异影响较小。沉积物中的海洋细菌分布表现区带化特征。海洋浮游细菌主要属于-变形菌纲、-变形菌、拟杆菌纲等。海底沉积物中酸杆菌门、 -变形菌纲、-变形菌、 -变形菌纲、拟杆菌纲等多种类型菌种。近年来，不断有从海洋中新类群的发现。海洋细菌第十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋真细菌的分布浮游放

6、线菌是海洋放线菌的重要组成部分，数量处于中等丰度水平，相关报道较少。海洋沉积物中最重要的真细细类群。其中浅海区以链霉菌为主，也有较多游动放线菌；而深海区沉积物中的优势放线菌为小孢囊菌和诺卡氏菌。无脊椎动物及海洋植物的表面或体内存在着相当部分的海洋放细线菌，研究得较多的是海绵。海洋放线菌第十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋真细菌的分布迄今为止发现的海洋蓝细菌主要属于原绿球藻属（Prochlorococcus）和聚球藻属（Synechococcus）。是海洋初级生产者的重要组成聚球菌分布于热带和温带海域。粒径为0.5-1.5um。通常比其消费者微型原生动物至少高一个数量级，足以作为

7、微型原生动物的重要食物源。对总初级生产力的贡献在世界大多数海区为20-60原绿球菌(Prochlorococcus) 分布广泛。粒径为0.4-0.8um。丰度大于聚球菌，对总初级生产力的贡献约为50%海洋蓝细菌第十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋真菌的分布木生真菌藻体真菌红树林真菌海草真菌寄生动物体真菌海底沉积物真菌存在于漂流木、沉积木。多数为子囊菌。其分布特点为热带海域和浅海较广泛。种类与丰度受季节及附着基质影响。生活方式为腐生、寄生或共生。海藻及其代谢物对其分布影响显著。如含单宁酸的马尾藻真菌极少；红藻上有数量较多的酵母菌而褐藻相对较少，因后者分泌酚类。多数为腐生，能分解红

8、树的枯枝败叶，为海洋提供有机物碎片。多栖于海草的叶部和根部，数量少。寄生于动物的外骨骼及肠道等。发现不同海域沉积物中都有真菌，但鉴定的很少。第十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋真核微藻的分布寒带种：最适温度小于4。小于0左右为寒带种； 0- 4来亚寒带种。 温带种：最适温度4- 20 。 4- 12为冷温带种12- 20为暖温带种。 热带种：最适温度大于 20 。 20- 25为亚热带种；大于25为热带种。主要影响因子为光强。分喜光藻与适阴藻。海底的分布与沉积物的组成及大小相关，含沙粒的多于泥泞。双峰模式：温带海域春、秋各有一个高峰（受光强、营养盐影响）。单峰模式：寒带海域春季

9、一高峰；某些温带海域（受径流影响）。水平模式：多见热带海域（季节不明显）水平分布垂直分布季节变化第十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月海洋病毒的分布季节、水深、光密度、温度、盐度等理化因子影响海洋浮游病毒的分布。 赤潮发生期病毒丰度骤增。 丰度随宿主变化而变化。病毒丰度与宿主丰度间的比值（virus-to-bacterium ratio,VBR）是研究病毒侵染对水生菌群影响的重要参数。底栖病毒丰度大于浮游病毒丰度。VBR也大于浮游病毒沉积层深度增加病毒丰度及VBR都降低。浮游病毒底栖病毒第十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月4.1微生物生态学研究中的传统方法样品的采集 微生

10、物菌量计数 富集培养和 菌种分离最大或然值法 活菌计数法第十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月4.2微生物生态学研究中的分子生物学方法核酸探针杂交技术PCR特异性扩增技术rRNA基因同源性分析方法第十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月核酸探针杂交技术核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上或细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针(100-1000bp)，也可以是短的寡核苷酸(10-50bp)。

11、杂交方式可以是菌落杂交、狭缝杂交或原位杂交。第十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月菌落杂交该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。杂交探针不仅可以鉴定细菌克隆也可以鉴定噬菌体形成的噬菌斑。首先将克隆或噬菌斑转移到纤维素膜或尼龙膜上，去掉所有的残留物，只留下DNA，这种处理同时导致了DNA变性，使双链的氢键断裂形成单链分子。通过80短时间处理，将DNA分子固定在膜上（纤维素膜）；对于尼龙膜需要进行紫外交联，通过糖-磷酸中枢将分子连接到膜上。标记探针，加热变性，加入到杂交膜上进行杂交，然后洗去未结合的探针，干燥，接合探针的位置就可以检测出来。第二十张，PPT共四十六页，

12、创作于2022年6月斑点杂交或狭缝杂交法 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上用标记探针与之杂交自显影或显色反应检测杂交信号分析结果。 优点： 简便、快速、灵敏、样本用量少； 缺点： 特异性不高，有一定比例的假阳性。 用途： 检测样本中存在的微量DNA或RNA 第二十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月原位杂交 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而 检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功

13、能状态。有第二十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月PCR特异性扩增技术在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂的混合物中，且含量极低，若探测这种复杂群体中特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。PCR技术使靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR，competitive PCR、nested PCR、RAPD、ARDRA等。第二十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月第一步：第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。第二步：第二套引物对第一轮P

14、CR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。Nested PCR第二十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月competitive PCR是一种定量PCR（quantitative PCR），通过向PCR体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具

15、有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。对竞争性模板作系列稀释后加入到恒量的样品DNA中进行PCR，靶基因的量取决于所添加的竞争性DNA片段的量，使两者的PCR终产物有相等摩尔数。 competitive PCR第二十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月用那些对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。其分析得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的。但不足以用来估测群落的微生物多样性。RAPD (randomly

16、 amplified polymorphic DNA)第二十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月rRNA基因分析方法rRNA approach是综合应用多项分子生物技术对细胞中rRNA基因进行分析，从而揭示微生物多样性。所使用的技术主要包括环境样品中DNA的提取、引物及探针的设计、PCR扩增、梯度胶电泳（主要是DGGE和TGGE）、限制性内切酶长度多态型（RFLP）、基因文库的筛选、序列测定、序列分析及系统进化树构建、斑点杂交和全细胞原位杂交及巢式杂交等。第二十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月微生物样品基因组DNA的提取 16srRNA基因片段的获得（pcr） 16srRN

17、A基因片段的分析 16s rRNA基因分析步骤第二十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月肠道微生物样品基因组DNA的提取rRNA的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易降解，因此一般研究多采用提取细胞总DNA。肠道环境中存在的细菌种类繁多，形态及性质各异，必须尽可能无选择性地裂解肠道细菌细胞以得到代表性的核酸分子。菌体细胞裂解常用方法酶法化学法机械法目前认为最可靠的方法是：溶菌酶配合微珠振荡裂解，使肠道混合微生物的DNA充分释放，再用酚-氯仿抽提总DNA。第二十九张，PPT共四十六页，创作于2022年6月16srRNA基因片段的获得16SrRNA通用引物进行PCR扩增的一般程序94

18、96预变性25min 9495变性3060s4555退火60s6872延伸24min 最后6872延伸610min 缺点：可能出现嵌合产物和扩增偏嗜性现象。第三十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月16srRNA基因片段的分析1）将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16SrRNA数据库中序列比较，确定其进化树中位置，从而鉴定样品中可能存在的微生物种类。16SrRNA基因片段的分析方法特点：该方法获得信息最全面，但在样品复杂情况下测序工作繁重。主要应用：单株菌的鉴定；两种菌的同源性比较，确定其归属。2）16SrRNA基因片段的多态性分析（又叫DNA遗传指纹图谱技术）。经PCR后其产物为

19、序列等长但不同源的DNA混合物，常用DGGE、TGGE等手段分离。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。特点：PCR过程中的碱基插入等造成错误主要应用：微生物群体多样性；微生物种群动态分析等。第三十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月3）通过16SrRNA 种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息。此外，探针也可以直接与样品进行原位杂交，通过原位杂交不仅可以测定微生物丰度，且能分析它们的空间分布16SrRNA基因片段的分析方法特点：简单快速。主要应用：快速验证其它方法可能出现的假阴阳性；混合物中钓取已知特定种类。4

20、）对PCR产物进行RFLP或T-RFLP。将PCR产物酶切，通过观察酶切电泳图谱、数值分析，确定微生物基因的核糖体型，再同核糖体数据库中的已有数据进行比较分析。主要应用：微生物组成和不同微生物的种属关系分析。第三十二张，PPT共四十六页，创作于2022年6月样品的采集土壤和污泥样品的采集一般不要求无菌操作。而应当注意样品的深度。水体样品的采集，应视水体清洁程度而定，或直接采集或用滤纸过滤浓缩（要求容器和过滤器无菌及无菌操作）空气样品的采集：要求在无菌操作下进行滤纸过滤生物体上的样品采集，要求取下一定量的组织，用无菌溶液把其中的微生物洗涤下来。第三十三张，PPT共四十六页，创作于2022年6月富

21、集培养和菌种分离用一定的选择性培养基进行培养，把样品中所含的特殊微生物数量得到提高。一般进行23次富集培养分离通常还是采用与富集相同的培养基进行划线分离挑取单菌落再进行23次的纯化。第三十四张，PPT共四十六页，创作于2022年6月最大或然值法（MPN）适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群 。菌液经多次10倍稀释后，然后每个稀释度取35次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。应注意两点：菌液稀释度选择

22、要合适，原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般35个重复。第三十五张，PPT共四十六页，创作于2022年6月例1：如某一细菌在稀释法中的生长情况如下； 稀释度 10-3 10-4 10-5 l0-6 10-7 10-8 重复数 5 5 5 5 5 5 出现生长的管数 5 5 5 4 1 0其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数 即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。 确定数量指标：不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释

23、度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可此数加到前面相邻的第三位数上即可。 例2：如某一微生物生理群稀释培养记录为： 稀释度 l0-1 10-2 10-3 l0-4 10-5 10-6 重复数 4 4 4 4 4 4 出现生长的管数 4 4 3 2 1 0数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30102个。 第三十六张，PPT共四十六页，创作于2022年6月附表23-1 几种主要微生物生理群MPN计数法一览表微生物生理群培养基常用稀释度常用重复次数培养时间 (天)主 要 检 查 方 法氨化细菌蛋白胨氨化培养基0-610

24、-947根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。亚硝酸细菌铵盐培养基0-210-7314根据培养液加格利斯试剂及的反应，出现绛红色证明有NO-2生成；或在培养中加锌碘淀粉试剂及体积比值为20%的H2SO4，若出现蓝色，证明有NO-3生成。硝酸细菌亚硝酸盐培养基0-210-6314根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有NO-3生成。反硝化细菌反硝化细菌培养基0-410-8314根据杜氏小管有无气体，确定有无N2生成；利用格利斯试剂及和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无NO-2生成及有无NH3存在，判断反硝化作用进行情况。好气性自生固氮菌阿须贝无氮培养基0-210-

25、637-14根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性自生固氮菌生长。好气性 纤维素分解菌赫奇逊噬纤维培养基0-110-5314根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有无好气性纤维素分解细菌的生长。厌气性纤维素分解菌嫌气性纤维素分解细菌培养基0-110-5314-21根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤维素分解细菌的生长。硫化细菌硫化细菌培养基0-210-8321-23在每管培养液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出现，则证明有硫化菌活动。反硫化细菌斯塔克反硫化细菌培养基0-210-7321-30根

26、据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。第三十七张，PPT共四十六页，创作于2022年6月白色农业白色农业是指微生物资源产业化的工业型新农业，包括高科技生物工程的发酵工程和酶工程。白色农业生产环境高度洁净，生产过程不存在污染，其产品安全、无毒副作用 。目前白色农业的研究应用领域包括：微生物食品；微生物饲料；微生物肥料；微生物农药、兽药；微生物能源；微生物生态环境保护剂等。 第三十八张，PPT共四十六页，创作于2022年6月自然界中微生物酶活性测定水解酶类活性测定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、脱氢酶活性的测定微生物呼吸率测定第三十九张，PPT共四十六页，创作于2022

27、年6月第四十张，PPT共四十六页，创作于2022年6月Synechococcus colonies are found only in salt water, and contribute about 25% of primary production in pelagic waters. 第四十一张，PPT共四十六页，创作于2022年6月Prochlorococcus marinus, a tiny globular cyanobacterium. This type of organism is extremely abundant in the tropical and warm temperate regions of the open oceans, and some scientists claim it is the most abundant organism on eart