流式细胞术实验中处理样本方法

1、Word文档 流式细胞术实验中处理样本方法 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。接下来的 Protocol 中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。 一. 试剂预备Wash Buffer：PBS+1% FBS破膜剂（ICS）：用双蒸水配置 10 % Saponin（Sigma）。破膜固定剂：将配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀释 100 倍ICS Wash Buffer：将配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀释 100 倍。二. 细胞表

2、面染色收集各组细胞，进行细胞计数，加入适量 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，去上清，加入 50 l Wash Buffer 重悬。（可选）Live dead 染色，每管加 0.1 L Zombie GreenTM Dye（样品多时使用时可先稀释），震荡混匀，室温避光孵育 1015 min。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min，弃上清。封闭 Fc 受体：每管中加入 1 g/106 细胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗体封闭荧光抗体 Fc 受体引起的非特异性染色。震荡混匀，4 孵育 30 min（或室温避光 15 m

3、in）。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm，离心 5 min，弃上清。用适量体积 Wash Buffer 液重悬每个样本，将各组细胞等细胞数混合后分装到单染管和不染抗体管，作为流式检测时调整电压。单染管中加入相应表面染色抗体，同时在每个样本中加入 1 L percp CD3/106 细胞和 0.5 L PE CD4/106 细胞，震荡混匀，4 避光孵育 30 min（或室温避光 15 min）。用 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，弃上清。打孔或者加入 200 L 1% PFA（多聚甲醛）固定过夜。三. 胞内染色将全部管细胞固定打孔。每管加入

4、150 L 固定破膜剂，震荡混匀，4 避光孵育 20 min。ICS Wash Buffer 液洗涤，用法同 Wash Buffer 液。在相应的需要进行胞内染色的样本中加入适当量胞内染色抗体（如 APC IFN-抗体），4 孵育 30 min 或室温避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min。弃离心上清液，依据实际状况加入 200 L 或者 300 L Wash Buffer 液重悬。震荡混匀，流式上机。四. 留意事项每一步离心倒掉上清时可以先在试验台上铺几层平板纸，倾倒上清后可吸掉管口的液体。为了避开打孔剂对细胞形态的影响从而影响后续圈门影响试验结果，所以不管是否需要胞内染色，每个样本都需要打孔。染色时抗体的加入量可依据实际状况调整，为避开抗体浓度对染色的影响，样品染色体系不得大于 100 L。为削减染色时加样的误差，可配置表面染色抗体稀释液，双染或多色染色可把多种抗体稀释到一管中。按 10 L 或 5 L 体系，用 Wash Buffer 液稀释。为了避开游离抗体的结合消失假阳