层析分离方法

1、层析分离方法概述层析法一一是一种使不同分子相互分离的过程，当一混合样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体（移动相）通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。层析法的特点： 能分离一系列结构较为相似的成分，以达到一般分离方法难以达到的目的。层析常见种类及用途:a.柱层析一一分离量较大，主要用于分离制备；b.薄层层析一一主要用于分析鉴定，也可用于半微量制备。c.纸层析一一主要用于分析鉴定，也可用于半微量制备。层析法按分离原理大体上又可以分为吸附层析 （利用吸附能力的差别进行分离） ， 常用的吸附剂有氧化铝、 硅胶、 聚酰胺等；分配层析

2、（利用在二种不互溶的溶剂中分配比不同进行分离），常用的支持剂为硅胶、硅藻土、纤维粉等，反相硅胶（键合硅胶 ） 、液滴逆流层析则是分配层析与逆流分溶的发展；离子交换层析（利用离子解离强度不同进行分离），常用的离子交换树脂有强酸性 （磺酸型 ）、强碱性 （季胺型 ）、弱酸性（羧酸型） 、弱碱性 （三级胺型 ） ；电泳 （利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离） ，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳。其他有气体层析、凝胶层析、亲和层析等， 层析方法的选择：非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析；极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析；酸性、两性成分可用离子交换层析，有时也可用吸附层析及分配层析。

3、各类化合物适宜的层析方法：一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析，对极性较高的生物碱也可用分配层析，而对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。甙类的层析分离往往决定于甙元的性质，如皂甙、强心甙，一般可用分配层析或硅胶吸附层析。芳香油、甾体、萜类（结合成甙除外）包括萜类内酯，往往首选氧化铝及硅胶层析，若在氧化铝柱上有次级反应，则宜用硅胶吸附层析。d.黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。e.有机酸、氨基酸一般可选用离子交换层析，有时也用分配层析，有些氨基酸也可用活 性炭吸附层析。f.多肽、多糖等大分子化合物，常用凝胶层析、亲和层析、反相硅胶（键合硅胶）。第一部分柱层析第一章硅胶层

4、析一、层析用硅胶层析用硅胶一般以SiO2 xH2O表示，系多孔性的硅氧环 Siloxane（a度链结构，由于其骨架 TOC o 1-5 h z III- Si-O-Si-SL OHIII（a）（b）表面具有很多硅醇Silanol（b陛团，能吸着多量水分，此种水分几乎成游离状态存在，因此当加热至100c左右能可逆地被除去。硅胶的活性水分含量有关（见表7-1）,表7-1氧化铝和硅胶含水量与活性的比较硅胶加入水量（%）活性氧化铝加入水量（%）0I05II315III625IV1038IV15含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达 17%以上，吸附能力降低，而可作为分配层 析载体。 IO O-sro-

5、sroHO OII（c）硅胶于500c加热能不可逆地失去结合水（一般170c以上即有少量结合水失去），从硅醇结构变成硅氧环结构，若加热至1,100C则结合水尽失。由于硅胶的吸附能力主要与硅羟基数 量有关，因此加热温度过高吸附能力反而降低。有时硅胶层析具有吸附层析与分配层析的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。层析硅胶应是中性无色颗粒，但是由于制作过程常可带有酸性，如果酸性不强于pH5,一般已可使用。商品层析硅胶合格的判定PH值-一般先检查其是否中性。取硅胶一份混悬于100份水中放置，应得澄清的中性溶液。如滤液为酸性，应水洗至中性，再行活化处理。铁离子的检查-一般将硅胶混悬于盐酸中，搅拌，如含

6、铁离子则与盐酸结合成复合物而显黄色。有铁离子存在即预示有其他金属盐存在的可能性，因此最好以盐 酸洗涤处理。在特殊情况下，硅胶须经乙醴、氯仿等有机溶剂预洗，至洗出液蒸 干无残渣为止。由于硅胶容易吸水，因此用前最好经 120c烘24小时活化，可不作活性测定。硅胶的改良:向层析硅胶中加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果，称改良吸附剂。例如以硝酸银处理的硅胶对不饱和姓类有极好的分离作用。以110%复合试剂的水或丙酮溶表7-2复合试剂0.10.5 N酸或碱AgNO3硼酸、硼酸钠、碱式醋酸铅亚硫酸钠氯化铁 硫酸铜 铁氟化锌液，与硅胶混匀，待稍干后于110c干燥即可常用改良吸附剂选择性分离物pH敏

7、感物质(生物碱、酸性、酚性、两性物质)具有双键或三键物质多羟基化合物醛类 羟基唾咻类胺类 磺胺类二、硅胶吸附层析的应用硅胶层析的优、缺点：优点：(1)有些化合物用氧化铝层析，吸附剂副反应较多，而且某些副反应即使用中性氧化铝 仍难以避免。而硅胶作吸附剂虽也有个别发生异构化，但一般副反应较少；(2)某些酸性、酚性物质、色素等易与氧化铝结合而不宜使用氧化铝层析，硅胶则无此 特性；(3)氧化铝层析样品损失较多，而硅胶层析样品回收率较高。缺点：(1)即分离效果有时较氧化铝为差，对杂质的吸附能力差；(2)样品处理量相应的比氧化铝为低硅胶吸附层析的操作快速层析(Flash Chromatography)既快

8、速简便，又有相当分离效果压力表注；玻璃磨口连接处用弹簧或橡皮圈扣紧。橡皮管连接处一般在压力为1kg/cm2以下不会脱开。操作步骤.装柱A.干法向层析柱中加入 0.51cmn高的硅胶H(100200 mesh/目)，再将硅胶H (300400 mesh 左右，即38m(1g40 m)装入柱，敲紧或在出口处抽真空吸紧，使硅胶层高约1820cm,硅胶层面应水平，上部再加0.51cm高的纯净砂层或滤纸。然后加入洗脱用的溶 齐1J,加压赶去硅胶内气泡，溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约1517cm=B.湿法bi.即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌待空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中。最好一次倾入，否

9、则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段， 容易影响分离效果。b2.向硅胶中加入一定体积的溶剂，充分搅匀，加入到预先装有一定体积溶剂的层析柱内 (已加粗硅胶H),同时打开活塞放出溶剂，硅胶下降。加压赶去硅胶内气泡，至层高约1820cmi溶剂压至硅胶层顶面，此时硅胶层高约1517cnr.硅胶柱内包含溶剂体积的确定(干法)取一定体积Vo的溶剂，加压至砂板处，将层析柱的活塞稍打开，使溶剂滴入接受器中，当氧化铝柱上面的溶剂液面刚好降至填料表面，关闭活塞，量取接受器内溶剂量Vi。则VoVi即氧化铝柱内包含溶剂的体积 V。依据 V,在层析过程中，可知在什么时候开始收集流份。当变换溶剂的时

10、候，就可知道新换溶剂大致在何流份开始。.加样用尽量少的溶剂溶解样品，然后加至柱中，加压压入硅胶层。难溶样品拌入少量硅胶再 装入，上面再复以砂层。.洗脱根据薄层层析资料的判断，用在硅胶薄层板上欲分点为R=0.20.3的展开溶剂洗脱，如有多点需分离时，可以改变洗脱溶剂的比例。用减压阀控制压力以调节洗脱速度，收集储 分。而且为了尽量减少被分离化合物在层析柱中扩散，层析过程中不能有间歇。.样品收集每一储分用薄层板点样分析，每块薄层板上可点数个储分点，用原料做对照，前一块板 的最后一点应用于下一块板的第一点做对照点。将相同位置点的储分合并，蒸除溶剂。柱的粗细和进样量等的关系（表1）这时施加的压力约 0.

11、40.7kg/cm2（可用压力表指示）。为了达到最好分离效果，使用 者可根据具体样品摸索条件。ko OH3cOOC表1柱内径（mm1417253552硅胶用量（g）10163570150力口样量（g）0.20.51248流速(ml/min )510152030每一微分体积（ml）2.5481525H1.2g原料反应5d后，用硅胶薄层层析显示（展开剂：石油醴 /乙酸乙酯82）,主要为二个斑点：Rf分别为0.23和0.14,相应于未反应原料和产物。Rf=0.23,原料Rf=0.14,产物点照对料原，卜卜卜卜TTT T T T 卜卜卜01234567 89 10 11 12卜.卜4 4-4T-卜卜卜

12、卜卜12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24(2)(4)用快速层析法分离（柱内径25mm,青岛海洋化工厂硅胶H 35g,硅胶层加压后高17cm） 先用120ml石油醴/乙酸乙酯（82）洗脱，再用400ml石油醴/乙酸乙酯（82）洗脱。加压力0.7 kg/cm2,流速0.5ml/min。开始80ml未收集，以后收集15ml左右为一微分。储分 17: 0.01g,低极性物；储分815: 0.49g,相应于Rf 0.23的原料；储分1618:交叉储 分；储分1934:0.37g相应于Rf 0.14的产物。收集时间约1.5h。总之，此层析法可用于 Rf差0.05到0.

13、1的组分分离，一般在2h左右可分离一个样品， 既达到一般柱层析的分离效果，又节省了时间，而且溶剂和硅胶用量也可减少。对不太稳定 的化合物，用此法分离尤为适用。吸附柱层析硅胶的用量样品与吸附剂的比例可为13060,但必须根据分离工作度难度，较难分离者有时甚至可选用 15001000。硅胶吸附层析适用范围一一使用比较广泛，能用于非极性化合物，也能用于极性化合物，适用于芳香油、菇类、番体、生物碱、强心巾、葱酿类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪 酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。三、硅胶的再生.由于硅胶对杂质及色素吸附力差，因此回收操作比氧化铝简单，一般可用乙醇或甲醇洗涤， 或于索氏提

14、取器连续抽提除去杂质， 洗净的硅胶待溶剂挥发除去后，烘干活化处理即可使用。.硅胶的再生也可用510倍体积的1 %氢氧化钠煮沸半小时，如仍不成强碱性（以酚吹作指 示剂），可追加适量1%氢氧化钠，趁热过滤，以蒸储水洗三次，再以 36倍5%盐酸煮沸半 小时，以蒸储水洗至中性，120c活化，过筛即得。四、分配层析的原理及操作一种溶质在两种不相互溶的溶剂中振摇，当达到平衡时，溶质在两层中浓度都有恒定的 比例，这一比值称作该物质在这两种溶剂中的分配系数。如果需要分离的两种物质，在两相中的分配系数比较接近，则须利用不断地进行反复分 配，如使用逆流分溶及分配层析才能达到目的。.分配层析的原理分配层析是以一种多

15、孔物质吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在支持剂上，因此称为固定相。另用一非极性溶剂（与固定相不相互溶）洗脱，此洗脱剂在层析过程中始终是移动的，称为移动相。溶质在固定相和移动相之间，在 柱上作连续的、动态的不断分配，由于不同成分在两相间分配系数的差异而得以分开。.影响分离效果片的因素 一一两者的分配系数差值。如果相差较大，只要用较小的柱和 较少的硅胶用量即能满意地分离，如果分配系数差值极小，则同样重量的样品往往要用较大 的柱和用较多的硅胶才能分开。.分配层析所用多孔支持剂一一主要有硅胶、硅藻土（商品名Celite）、纤维粉等，近年 来并有用有机支持剂的，如微孔聚乙烯粉等。操作分配

16、层析所用的仪器操作一般与吸附层析相同，将预先选定的固定相溶剂（一般为水溶液或极性溶剂）加入支持剂硅胶中，搅拌混合均匀，倾入事先选定的移动相溶剂中， 激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡。层析管中放移动相（事先务必用固定相溶剂剧烈振摇， 互相饱和，以造成层析时稳定的平衡条件），将上述吸着固定相的硅胶湿法装柱，不断轻敲管 壁或加压，使固定相支持剂压紧。样品一般可溶于移动相中上柱，继以移动相洗脱，按固定 体积收集，分别浓缩处理。分配层析操作注意事项：（1）移动相体积常大于固定相510倍，即相当于以510倍体积的有机溶剂向水溶液萃 取，而分配系数的含意为溶质在两相中的浓度比，若体积增大，实际抽提出量也大。

17、因此在 分配层析中选择固定相与移动相时， 要考虑样品在两相中的分配比（样品于移动相中的浓度/ 样品于固定相中的浓度），应在0.10.2时较适宜。较大则很快从柱上洗脱，分离效果较差， 如分配比过大则可采用反相分配层析，即以非极性溶剂作固定相，极性溶剂作移动相。（2）所用固定相与移动相溶剂，务必相互饱和，否则层析过程中固定相体积不断减少或 增加，平衡条件就被扰乱。（3）选用支持齐1J （硅胶）与吸着固定相的比例为10.51即层析时硅胶吸有相当于本身重量50100%固定相溶剂，较为适宜。（4）样品上柱可米取三种方式：a.如样品能溶于移动相溶剂，可用少量移动相溶剂溶解，加于柱顶再行展开；b.如样品难溶

18、于移动相，易溶于固定相，则可用少量固定相溶剂溶解，用硅胶吸着，装于柱顶再行展开；c.如果样品在两相中溶解度均不大，则可溶于适当的溶剂，拌于干燥硅胶上，待溶剂挥 发去尽后，加50100%的固定相溶剂拌匀再上柱。（5）层析柱固定相支持剂段直径与长度的比为l 1020,对分配系数比较接近的成分分离，往往可加大至140以上。（6）分离样品时支持剂的用量一般较吸附层析为大，为 11001,000,主要决定于分离工作的难易，对分配系数比较接近的成分的分离甚至可采用110010,000。（7）为使溶质在两相间达到平衡，移动相流速宜慢些，大致固定相支持剂的直径与高度为2.6 50厘米，流速0.07毫升/分钟；

19、4.565厘米为0.3毫升/分钟；5.590厘米为0.6毫升/分钟；6.5115厘米为1.2毫升/分钟。（8）分配系数往往会因温度变化而变化。因此对要求较高的实验，层析管最好有隔层套 管，以便通水保持恒定的温度。五、分配层析溶剂系统的选择一般酸性酚性物质及生物碱类常可用缓冲液（酸、碱性溶液）作为固定相（见表7-5）。还可 根据具体化合物的溶解度、极性情况灵活选用。表7-5硅胶分配层析溶剂系统的选择化合物名称固定相移动相水溶性生物碱水或缓冲溶液醇缓冲溶液乙酸乙酯水氯仿或乙酸乙酯水乙酸乙酯（含0.5%甲醇）酚性化合物水环己烷有机酸0.05N 或 0.5N H2SO4环己烷：氯仿（或石油醴、苯、乙醴

20、）=3:1磷酸缓冲溶液氯仿：乙醐=1:1或环己烷氨基酸的DNP衍生物不同pH的缓冲溶液乙84、氯仿、止醇番体化合物水石油醴甲醇环己烷乙二醇甲苯甲酰胺异丙醛六、硅胶分配层析的应用分配层析分离主要决定于分配系数的差异，一般说各类型化合物均能适用，特别适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者，因此刚巧能弥补一般吸附层析（如氧化铝层析适用于亲脂性物质） 的不足。但分配层析样品处理量较少。分配层析往往适用于水溶性及极性较大的生物碱、甙类（强心甙，皂甙）、有机酸、酚性成分、糖类及氨基酸的衍生物，对某些非极化合物如番体、油酯等有时也可用反向分配层 析进行分离。七、硅胶分配层析操作实例狄戈辛 （Dig

21、oxin） 即异羟基洋地黄毒甙）的分离国产层析硅胶80100目用量为分离样品的100倍，加2/3量的水（预先以乙酸乙酯饱 和）调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比为1： 20 以上。取毛地黄次生花总花与12倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含 0.5% 甲醇 ）洗脱，分部收集，各流份均作纸层析及薄层层析（硅胶G 硬板 ）检查，比移值相同部分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得洋地黄毒花（Digitoxin）、羟基洋地黄毒花（Ci-toxin）、异羟基洋地黄毒花（Digoxin）等三种单体。硅胶 G 薄层层析展开溶剂：二氯乙烷-甲醇 -甲酰氨 （80： 19

22、： 1）；显色剂：三氯醋酸。第二章 氧化铝层析 氧化铝层析 适用于亲酯性成分分离。 广泛用于生物碱、甾体化合物、 强心甙、 精油、内酯化合物等中草药成分的分离。优缺点一一有价廉、分离效果好、再生容易等优点；缺点是能与部分酚性化合物（如有些黄酮类化合物、部分三萜酸）结合因而不能应用。一、各种氧化铝的制备及其应用层析用氧化铝的种类及用途：.碱性氧化铝pH 910。用于碳氢化合物的分离，和从碳氢化合物中除去含氧化合物， 以及某些对碱溶液比较稳定的中性色素、甾族化合物、生物碱、醇，以及其他中性、碱性物 质的分离。 中性氧化铝 pH7.5 。应用最广泛，适用于醛、酮、醌、某些甙及酸碱溶液中不稳定的化合物

23、如酯、内酯等化合物的分离。.酸性氧化铝pH 44.5。适用于天然及合成酸性色素及某些醛、酸的分离。 水提取液二、氧化铝的活化及活性的改变1 氧化铝的活化氧化铝的活性与含水量关系极大，在一定温度下除去水分就可以使氧化铝活化。氧化铝 加入一定量水即可使活性改变。活性水量的关系大致如图61。表6 1 氧化铝中加入水量与活性关系加入水量%氧化铝活性0I级3II级6III级10IV级15V级氧化铝（碱性、中性或酸性）的活化一一400c左右加温6小时，即得IR级氧化铝, 如果活化温度过高，引起氧化铝内部结构的改变，它的吸附力将引起不可逆的下降，而 不能供层析应用。三、氧化铝层析操作.操作基本与硅胶吸附层析

24、相同.氧化铝的用量一一一般采用样品量的2050倍，根据被分离化合物的性质而定。遇到 碳氢化合物如菇烯、倍半菇烯等，氧化铝对这些化合物的吸附力较弱，层析时氧化铝用量 略增，为样品量的100200倍，.层析洗脱用的溶剂a.洗脱能力一一与溶剂极性有关。极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步增加溶 剂的极性，可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物逐个洗脱，达到分离的目的。表6-4常用层析洗脱用溶剂次序与介电常数关系溶剂介电常数层析洗脱时使用次序己烷或石油醴1.88(1)苯2.30(2)氯仿5.20(3)乙醴4.50(4)乙醇25.80(5)水81.00(6)更换溶剂时，为了逐步提高溶剂的洗脱能力，常用混

25、合溶剂作为过渡，开始时逐渐缓慢地增加较大极性溶剂的比例（自010%）; 以后每次递增510%,使较大极性溶剂比例自 10%递增到50%;然后再更换较大极性溶剂。实际操作过程中，根据薄层层析资料的判断，及初步层析结果的分析。b. 层析用溶剂的处理：.除去溶剂中某些极性较大的杂质（如氯仿中的乙醉）；.除去溶剂中某些不挥发物质，以免污染洗脱流份；.并应注意溶剂中含水量。4 氧化铝的再生层析后，除去氧化铝柱上端含聚合物及带有深颜色的氧化铝；用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后，可重复使用；为了使吸附在氧化铝表面的有机物分解，高温活化时间可适当延长。活化后，氧化铝的颜色比使用后的稍淡。一

26、般来说，氧化铝可重复使用多次，随层析过程中有机物污染的程度而定。四、氧化铝层析过程中引起的一些副反应氧化铝层析时引起的一些副反应，例如某些化合物层析时引起的异构化、氧化、皂化、水合，以及脱氯化氢形成双键等反应，已有一些报道。进行层析时应加以注意。1溶剂洗脱法洋艾中内酯成分的分离第三章 聚酰胺层析聚酰胺（Polyamide）-一是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，商品名：锦纶、尼龙。聚酰胺层析用途一一分离极性和非极性物质的广泛的层析方法，如黄酮体、酚类、酶类、有机酸、生物碱、萜类、甾体、甙类、糖类、氨基酸衍生物、核苷类等。 尤其是对黄酮体、酚类、醌类等物质的分离，远比其他方法优越。特点： 对黄酮体

27、等物质的层析是可逆的， 分离效果高， 可使性质极相近的类似物得到分离；其柱层析的样品容量大（吸附剂用量为样品量的1020倍 ），适于制备分离。一、聚酰胺的性质层析用聚酰胺的种类：常用锦纶6（聚己内酰胺）、锦纶 66（聚己二酰己二胺） ，其亲水、亲脂性能较好。既可分离水溶性物质，又可分离脂溶性物质。聚酰胺的溶解性和稳定性：锦纶 6 和锦纶 66可溶于浓盐酸、甲酸；微溶于乙酸、苯酚等溶剂；不溶于水、甲醇、乙醇、 丙酮、 乙醚、 氯仿、 苯等常用有机济剂。 对碱较稳定， 对酸的稳定性较差（特别是无机酸） ，温度高时更敏感。分子量的大小对聚酰胺的理化性质及层析性能的影响：锦纶6和锦纶66的分子量在16

28、,000-20,000较好。其熔点在200c以上。分子量太小的 聚酰胺，在常用有机溶剂中的溶解度较大，而且不太稳定，在处理过程中易被酸、碱破坏； 在层析过程中易溶于洗脱剂而污染分离样品。分子量太大的聚酰胺，亲水性及可塑性较差， 亦不适用。二、基本原理(一)吸附层析一般认为聚酰胺层析是吸附层析。由于聚酰胺分子内有很多酰胺键，可与酚类、酸类、 酶类、硝基化合物等形成氢键，因而对这些物质产生了吸附作用。形式氢键的能力与溶剂有关，一般在水中形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱，在 碱性溶剂中最弱。各种化合物由于与聚酰胺形成氢键的能力不同，聚酰胺对它们的吸附力也 不同。在含水溶剂系统中，大致有下列规律：

29、(1)形成氢键的基团(如：酚羟基、竣基、酿基、硝基等)越多，则吸附力越强。如： 丁二酸丁酸OHOHOHHO OHOH(2)形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附 力减小。如：OHOHOHOH aOHOH（3）芳香核、共腕双键多者吸附力大，少者吸附力小。如:OHOH（4）若形成分子内氢键，则使化合物的吸附力减小。如:Oh0（二）“双重层析”聚酰胺具有“双重层析”性能。因聚酰胺分子中既有非极性的脂肪链，又有极性酰胺基 团。当用极性移动相（如含水溶剂系统）时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行径类似于反 相分配层析。当用非极性移动相时，聚酰胺则作为极性固定相，其层析

30、行径类似正相分配层 析。例：聚酰胺层析可以分离某些很难与聚酰胺形成氢键的物质一一菇类、番体、生物碱等。 如：黄酮体花与西元的分离（前者比后者极性大），若以含水溶剂（如：甲醇一水）作洗脱剂， 黄酮体花比其西元先洗脱下来；而非极性溶剂 （如：氯仿一甲醇）洗脱结果恰巧相反一一黄 酮体茂元比其正先洗脱下来。三、聚酰胺层析的应用.分离黄酮体及某些酚类物质一一聚酰胺层析是最有效的方法，可将植物粗提物中的黄 酮体与非黄酮体、黄酮体花元与正分开。若采用含水溶剂系统（如：乙醇-水），非黄酮体水溶性成分及少数黄酮体花可用水冲洗下来。大多数黄酮体正在1030%乙醇液中洗脱下来，而西元则在50 96%乙醇液中才能冲洗

31、下来（见实例1）。黄酮体西元的混合物用非极性溶剂 系统分离较好。.除去植物粗提取物中的糅质一一聚酰胺对糅质的吸附特别强，高分子糅质对聚酰胺的吸附是不可逆的。聚酰胺层析的溶剂系统（1）.含水溶剂系统适用于各种花类、 糖类、有机酸等水溶性成分的分离，以及黄酮体正与 西元、黄酮体与水溶性脂肪族成分（如糖类、脂肪族有机酸）等的分离。在含水溶剂系统中增加有机溶剂的比例，可使 Rf值升高，洗脱能力增加。(2)非极性溶剂系统。非极性溶剂系统则用于菇类、番体、黄酮体花元、酚类、酶类等极性不太高的化合物的分离。 在该溶剂系统中增加极性溶剂的比例，可使 Rf值升高，洗脱能 力增加。若在各种溶剂系统中加入少量酸或碱

32、，可克服层析中的“拖尾”现象，并使色带集中表3-1聚酰胺薄膜层析常用溶剂系统化合物类别黄酮体花元黄酮体花酚类酿类糖类生物碱氨基酸衍生物番体，菇类番体正展层溶剂氯仿-甲醇(94:6或96:4),氯仿-甲醇-丁酮(12:2:1)苯-甲醇-丁酮(90:6:4或84:8:8),氯仿-甲醇-甲酸( 60:38:2)氯仿-甲醇-叱噬( 70:22:8),氯仿-甲醇-苯酚( 64:28:8)甲醇-醋酸-水(90:5:5),甲醇-水(4:1),乙醇-水(1:1),丙酮-水(1:1)异丙醇-水(3:2), 30%60%醋酸，醋酸乙脂95%乙醇(6:4)氯仿-甲醇(7:3),正丁醇-乙醇-水(1:4:5),氯仿-

33、甲醇-丁酮(65:25:10) 丙酮-水(1:1),苯-甲醇-醋酸(45:8:4),环己烷-醋酸(93:7), 10%醋酸 10%醋酸，正己烷-苯-醋酸(4:1:0.5),石油醴-苯-醋酸(10:10:5) 醋酸乙酯-甲醇(8:1),正丁醇-丙酮-水-醋酸(6:2:1:1)环己烷-醋酸乙酯-正丙醇-二甲基胺(30:2.5:2.9:0.1)水-乙醇-二甲基胺(88:12:0.1)苯-醋酸(8:2或9:1), 50%醋酸,甲酸-水(1.5:100或1:1)醋酸乙酯-甲醇-醋酸( 20:1:1), 0.05M磷酸三钠-乙醇(3:1)二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇( 5:10:30:20),氯仿-醋酸(

34、8:2)己烷-丙酮(4:1),氯仿-丙酮(4:1)甲醇-水-甲醇( 60:35，醋酸乙醋-甲醇-水-甲酸(50:20:25四、酰胺层析实验技术.聚酰胺粉的处理锦纶中通常有两种杂质：一种是锦纶的聚合原料单体及其小分子聚合物。另一种是蜡质(锦纶丝在制成后，表面曾涂过一层蜡)。这些杂质必须除去，否则原料单体及其小分子聚合物可 与酚类物质形成复合物。蜡质能被醇液洗脱下来，与分离之物质混在一起难以除去。除去单体及小分子聚合物的方法：a.除单体及小分子聚合物 -二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇 (5:10:30:20)混合液洗涤。b.除去蜡质-用甲醇-二氯乙烷(1:1)混合液洗涤。依次

35、用 9095%乙醇、 5%NaOH 、 10%醋酸洗涤：取制得的聚酰胺粉以9095% 乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入层析柱中。用34倍体积的 9095% 乙醇洗涤：洗至洗液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用22.5倍体积的 5NaOH 水溶液、 1 倍体积的蒸馏水、 22.5倍体积的 10%醋酸水溶液洗涤，最后 用蒸馏水洗至中性，备用。2柱层析操作装柱：a. 用含水溶剂系统层析，常 以水装柱 层析管内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部。并除去玻璃纤维中的气泡。处理过的聚酰胺粉以蒸馏水浸泡 l 小时左右，不断搅拌 除去气泡。倒入柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。一般在上节所

36、述锦纶的处理中 柱已装好，不必再装。 b. 用非极性溶剂系统层析时，常以溶剂组份中极性低的组份装柱。若以氯仿装柱，因其比重较大使聚酰胺粉浮在上面。加样时应将柱底端的氯仿层放出，并立即加样，加样后顶端以棉花塞紧。洗脱过程中 ， 需关柱暂停时，应将顶端的多余氯仿液放出，否则，聚酰胺会浮起而搅乱层带。(2)加样：聚酰胺的样品容量较大。一般每 100毫升聚酰胺粉可上样1.52.5克。可根据具体情况适当增加或减少 当欲分离之成分在样品中的相对含量较低，且易吸附于柱上，而其他成分不易吸附时，则可将上柱量增大。使大部分成分很快从柱上流下，而欲分离之成分经适当洗脱即可得到；当欲分离之成分不易被吸附且不易吸附之

37、成分不只一个，则样品上柱量必须大大减少。若利用聚酰胺除去鞣质，样品上柱量可大大增加。通常观察鞣质在柱上形成橙红色色带的移动，当样品加至该色带移至柱的近底端时，停止加样。样品常用洗脱剂溶解。浓度在 2030% 。 不溶样品可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易挥发溶剂溶解。拌入干粉中，拌匀后将溶剂减压蒸去，以洗脱剂浸泡装入柱中。洗脱：溶剂体系：a.含水溶剂水，由稀至浓的乙醇液(10%、30%、50%、70%、95%)依次洗脱；b.非极性溶剂一一氯仿，氯仿-甲醇(19:1, 10:1, 5:1, 2:1, l;1),甲醇依次洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用 3.5%氨水洗脱。c.若用锦纶分离芳香硝基化合

38、物或DNP-氨基酸。因其对锦纶的吸附很牢，上述洗脱剂很难洗脱，可用 DMF-HOAc-H 2O-EtOH (5;l0:30:20)混合液洗脱。洗脱剂的更换一般根据洗脱液的颜色，当颜色变为很淡时更换下一种溶剂。以适当体积分瓶收集，分瓶浓缩。各瓶浓缩液以聚酰胺薄膜层析检查其成分，成分相同者合并。聚酰胺粉的回收用过之聚酰胺粉，一般用 5%NaOH洗涤，洗至氢氧化钠液颜色极淡为止。有时因某些 糅质与聚酰胺有不可逆吸附，用氢氧化钠很难洗脱时，可用 5%NaOH液在柱中浸泡。每天 将柱中之氢氧化钠液放出一次，并加入新的氢氧化钠液浸泡，这样浸泡洗涤一周后，糅质可 基本沈完。然后用蒸储水洗至 pH89,再以2

39、倍量10%醋酸洗，最后以蒸储水洗至中性， 供重复使用。3.聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜一一将聚酰胺在涤纶片基上涂成一薄膜，供薄层色谱用，市售产品出厂 时己初步活化。活化一一使用时，可将膜在恒温干燥箱内 40C60c干燥4h,取出置干燥器内冷却， 备用。再生一一层析后可用丙酮和氨水（25%28%）或丙酮和90%甲酸（9:1 , V/V）浸泡6h , 把污物洗去后，再用甲醇洗涤，凉干后活化处理后重复使用。一般可重复使用10次以上。五、聚酰胺层析操作实例.染料木素和染料木素-4-葡萄糖花的分离槐Sophora japonica L.角的酒精提取物，以酸水解后析出沉淀物，该沉淀物依次以乙 醴、甲醇提取。取甲醇

40、提取物28克，以甲醇溶解，拌入聚酰胺粉（60克）中，减压抽干，磨细。 加在预先以水为溶剂填装的 5.3 59厘米的聚酰胺柱顶。依次以水、30%乙醇、50%乙醇洗 脱，每种溶剂洗至有很少物质洗下时改换下种溶剂。在30%乙醇洗脱之各流份中，析出白色针品，以二甲基甲酰胺复结晶，熔点257 C,经鉴定为染料木素-4-葡萄糖花 （Genistein-4-glucoside Sophoricoside） 50%乙醇洗脱物的前几个流份，析出黄色针晶，以 甲醇-水混合液复结晶，熔点：294296C,经鉴定为染料木素（Genisteinb第四章大孔吸附树脂层析一、原理大孔吸附树脂是一种不含交换基团，具有大孔结构

41、的高分子吸附剂。它的性质与活性炭 相似，可以有效地吸附不同化学性质的各种类型化合物，它所具有的吸附性与范德华引力或 形成氢键吸附有关。.大孔吸附树脂具有吸附作用的一个重要方面是因为它具有各种不同的表面性质，例 如疏水性的聚苯乙烯能将低极性的有机化合物吸附，主要依靠分子中的亲脂键、偶极离子及 氢键的作用。.大孔吸附树脂的吸附能力不仅与自身的化学论结构、物理性能有关、而且与溶质的 性质有关。根据“相似相溶”的原则，一般非极性吸附树脂适宜于从极性溶剂(如水)中吸附 非极性物质，极性树脂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质，而中极性吸附树脂则对上述两种 情况都具有吸附力。由于是分子吸附，这种吸附力的特点是解

42、吸容易。.止匕外，由于吸附树脂具有多孔性网状结构，还具有筛选性分离的特点，因此欲分离 的物质可依其分子体积的大小及吸附力的强弱，在一定规格的大孔吸附树脂上，以适当的溶 剂洗脱而达到分离的目的。优点：大孔吸附树脂由于具有选择性好，吸附容量大，机械强度高，再生处理方便，吸附速度 快，解吸容易等优点，用途：现广泛应用于工业废水的处理，维生素、抗生素的分离提纯及水溶性天然产物成分的提 纯,近年多用于皂花及其它花类化合物的分离。二、大孔吸附树脂的类型及性能：理化性质一一大孔吸附树脂一般为白色颗粒状，粒度多为20目60目，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性较好，不受无机盐类存在的影响。按

43、性能类型：.非极性吸附树脂一一以苯乙烯为单位、二乙烯苯为交联剂聚合而成，故称为芳香族 吸附剂。.中极性吸附树脂一一以甲基丙烯酸酯作为单体和交联剂聚合而成，也称为脂肪族吸附齐.极性吸附剂在结构中含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。日本三菱化学(Mitsubishi Chemical)大孔吸附树脂DIAIONHP20DIAIONHP21SEPABEADSSP825SEPABEADSSP850SEPABEADSSP207DIAIONHP2MG(L)化学结构-CH2 (-C-CH-CH2-CH-；H2-CH-_ CH2-CH. CH2-CH-CH2-CH-、BrCH3CH 311CH2_ C_ CH2_ C1

44、1COc_och31IIOO1(CH 2)2 1O C=O 1CH 2 C1CH3孔容积(mL/g)1.31.11.41.21.31.2比表向积(m2/g)60057010001000600500孔半径(nm)2085.73.81112表观密度(g/L-R)680625690670780720水含量(%)55-6545-5552-6246-5243-5355-65均匀系数1.61.6适宜分离成分皂甘C、黄酮、菇类、天然色素、内酯酚性黄、黄酮、弱极性生物碱、皂玳、内酯生物碱、酚性黄、黄酮、低聚糖?苯乙烯类Diaion HP20、HP21是大孔合成吸附和脱附树脂，有相当大的孔径适合对大分子的吸附。

45、用通常的有机溶剂、酸、碱来洗脱被吸附的物质。在工业上被广泛应用，特别对天然产物和小分子的吸附、脱盐、脱色。? 苯乙烯类SEPABEADS SP825、SP850树脂是大孔聚苯乙烯吸附树脂。比HP系列树脂有更大的表面积的和窄均匀的孔径分布。其表面积约为 HP20树脂的2倍，对小分子的吸附容量 是HP20的2倍以( 1500MW)可用于吸附、脱盐、脱色。?化学改性的苯乙烯类 SEPABEADS SP207是用澳基团化学键合到己交联的聚苯乙烯基体上的大孔吸附树脂。他比纯聚苯乙烯树脂有更高的憎水性(对非极性分子有较高的选择性)。比其他苯乙烧树脂的比重高1.2倍左右向它适合用于逆流洗脱 (EBA)?甲基

46、丙烯酸酯类 Diaion HP2MG。是一种中等极性的吸附树脂，有较强的亲水性。它适 合脱盐和吸附较强极性的化合物。?三菱大孔吸附树脂使用性能1、韧性大、机械强度高、不易破损。2、载量大，是国产同等类型的35倍。3、寿命长、注意保护使用可重复使用100次以上。4、颗粒均匀、分离效果好。5、残留物少、干净己处理极其方便。7、膨胀系数小、分离效果好。美国罗门哈斯(ROHMHAAS)Amberlite XAD系列大孔吸附树脂树脂脂号 树牌比表面积 (m2/g)平均孔径(nm)偶极距平均粒径(师)均一系数D90/D40应用聚 苯 乙 烯 基XAD4750100.46401.6除去有机溶 剂和其他小 分

47、子非极性 物质XAD1680015一7001.6提取小分子 的抗生素和 植物有效成 分,如黄酮、 皂芭类物质XAD160080015一4001.2提取小分子 的抗生素和 植物有效成 分，有色谱分 离作用XAD118070040一5301.6提取大分子 的抗生素、维 生素、多肽和动植物后效 成分甲 基 丙 烯 酸 酯XAD7HP500451.85601.7提取多肽和 植物色素、多 酚类物质XAD761200601.67001.5提取蛋白质、 多肽和动植 物启效成分， 用于果酸、有 机酸的脱色树脂类型应用的选择依据树脂的孔径、表面积及极性不同，.分离极性较大的化合物应选用中极性的树脂，而极性较小的

48、化合物则选用非极性树 脂来分离。.凡要吸附分子量大的化合物，应选择较大孔径的树脂，吸附分子量小的物质，则选 择比表面积高及孔径较小的吸附剂。三、大孔吸附树脂的预处理及再生1、预处理为了保护树脂不受霉菌的侵蚀，新购的树脂一般是用氯化钠及硫酸钠处理过的，同时树 脂内部尚存在未聚合的单体，残余的致孔剂、引发剂、分散剂等，故用前必须除掉。.将新购的大孔树脂加足量的水， 使其溶胀至体积不再增加为止，然后倒入内有少许水的交换柱内，使管内树脂量不要超过管长 1/2以上，水在柱内的高度没过树脂；.装好柱后，先缓慢地让水从柱的底部流入反洗，并逐渐加速，使树脂全部移动，直 至树脂内的气泡全部赶出，同时悬浮不洁物、

49、破碎及过小颗粒从管顶逸出为止；.然后再用甲醇或95%乙醇或丙酬浸泡24h后洗涤，也可将树脂与有机溶剂一起在水浴 上回流，直到洗涤液加水混合后不呈白色浑浊为止，最后用水洗掉所用的有机溶剂，备用。或甲醇(也可是乙醇)与水交替洗脱 23次，每次用量为树脂体积的23倍，最后用水 洗脱。2、再生.若洗脱剂为非水溶性的有机溶剂，可用甲醇反复冲洗树脂柱。.若洗脱剂为水溶性的，用蒸储水反冲洗净洗脱剂即可。.经反复使用，当吸附树脂颜色变深，吸附效果下降时，可用3%盐酸或3%氢氧化钠依 次浸泡12h,然后用蒸储水洗至中性即可。.如果柱上有悬浮物和破碎的小树脂颗粒，可将树脂盛于烧杯中，用浮选法除去，再重新装柱。大孔

50、吸附树脂应湿态保存，如部分颗粒暴露在空气中失水，可用乙醇或丙酮浸渍处理后使用。四、装柱和上样 大孔吸附树脂采用湿法装柱，湿法上样。上样液一般为浓缩液，以澄清的为好， 由于上样溶液的pH对化合物的分离影响很大，所以应引起注意。一般酸性化合物在适当的酸性溶液中可被充分吸附，碱性化合物在碱性条件下易被吸附，中性化合物则在中性条件下吸附较好，树脂吸附容量的测定取10mg/ml的溶液10ml,加入0.1幽脂，摇匀，（于冰箱中）放置3d.,充分吸附后，测定溶液浓度，计算差值。 各量可视情况而变。五、洗脱剂的选择是采用 对化合物有较好溶解度的溶剂 ，这样可以得到高浓度的洗脱液。 最常用的是 水、低级醇、丙酮

51、、乙酸乙酯等；对非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱力越强（丙酮乙醇 水）。对极性大孔树脂和极性较大的化合物，则用极性强的溶剂更能满意分离；对弱酸性的化合物可用碱来解吸, 如 XAD-4 吸附酚后 , 可用氢氧化钠解吸, 氢氧化钠最适浓度为 0.2%0.4%;对弱碱性物质, 可用酸来解吸；可用几种不同浓度洗脱剂洗脱，以确定最佳洗脱剂浓度, 或采用不同极性梯度的洗脱剂分别洗下不同组分；洗脱速度一般控制在0.5ml/min5ml/min 比较合适 。 洗脱液经检测后 , 将相同组分合并。六、树脂柱的清洗层析后的树脂表面或内部残留着杂质。杂质中非吸附性成分一般用水洗涤即可，吸附性杂质可根据其性质

52、，选用低浓度的醇洗除，一般情况下，洗至近无色即可。第五章 活性炭层析用途 活性炭柱层析对于分离水溶性物质（如氨基酸、糖类及某些甙类）是一种较好的方法，它是分离水溶性物质的主要方法之一。优点 样品上柱量大（一般每100毫升活性炭可上样510克） ，分离效果好，活性炭来源较易，价格便宜，适用于大量制备分离。缺点一一由于活性炭的生产原料不同，制备方法及规格不一，具吸附力不象氧化铝、硅胶那样易于控制，目前尚无测定其吸附力级别的理想方法，因而限制了其广泛应用。一、活性炭的来源、规格及性能来源一一动物炭、植物炭和矿物(煤)炭三种。分别采用动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化 而成。医药用活性炭及层析用活性炭多以

53、木屑做原料，加氯化锌在700800c高温炭化、活化， 经适当处理除去杂质而制成。 由于植物体内含有各种金属离子及生产过程中加入氯化锌，故易含有微量重金属离子。用于层析的活性炭，基本上可以分三类：(1) 粉末状活性炭：一般采用医药用或化学纯活性炭。该类活性炭颗粒极细，呈粉末状，其总表而积特别大，吸附力及吸附量也特别大，是活性炭中吸附力最强的一类。但是，由于其颗粒太细，在层析过程中流速极慢，需要加压或减压操作。(2)颗粒状活性炭一一颗粒较前者为大，其总表面积也相应减小，吸附力及吸附量也较次于前者。但是，在层析过程中流速易于控制，勿需加压或减压操作。锦纶 -活性炭：以锦纶为粘合剂，将粉末状活性炭制成

54、颗粒。其总表面积较颗粒状活性炭为大， 较粉末状活性炭为小， 其吸附力较二者皆弱。 因为锦纶不仅单纯起一种粘合作用，它也是一种活性炭的脱活性剂， 因此可用于分离前两种活性炭吸附太强而不易洗脱的化合物。用其分离酸性氨基酸及碱性氨基酸：可取得很好效果。流速易控制，操作简便。二、活性炭的选择及运用选择适当吸附力的活性炭欲分离的物质不易被活性炭吸附时，则要选择吸附力强的活性炭。当欲分离的物质很易被活性炭吸附时，则要选择吸附力弱的活性炭。在首次分离某种样品时，一般首先选用第二类活性炭。当发现其对欲分离之物质因不能吸附而未达到分离目的时，则改用第一类活性炭。当发现其对欲分离之物质因吸附过强而不能洗脱，或因很

55、难洗脱而造成洗脱溶剂体积太大流份不集中时，则改用第三类活性炭。一般尽量避免应用第一类活性炭 (即粉末状活性炭) ，它的吸附力太强，有许多物质吸在上面极难洗脱。三类活性炭联合应用分离较复杂的植物成分将欲分离之样品先通过第三类活性炭柱，对活性炭附着力最强的物质吸在该柱上。其不吸附物再通过第二类活性炭柱，附着力稍次之物质吸在该柱上。其不被吸附物最后通过第一类活性炭柱。这样依次通过三根柱，在三根柱上吸附的物质分别用适当的溶剂洗脱，就达到 较好的分离效果。三、活性炭对物质的吸附规律及应用活性炭在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。在一定条件下，对不同物质的吸附力如下：对极性基团(如COOH ，

56、NH 2，一OH 等)多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。例如，活性炭对酸性氨基酸和碱性氨基酸的吸附力大于中性氨基酸。可借，可将酸性氨基酸或碱性氨墓酸与中性氨基酸分开。又如，活性炭对羟基脯氨酸的吸附力大于脯氨酸，因为羟基脯氨酸比脯氨酸多一个羟基。对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。可将芳香族氨基酸与脂肪族氨基酸(两者的氨基和羧基数目相同)分开。也可将某些水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开。对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。例如，活性炭对肽的吸附力大于氨基酸，对多糖的吸附力大于单糖。因此可利用活性炭分离氨基酸与肽，单糖与多糖。氨基酸、单糖先洗脱下来；肽、多糖后洗脱下来。四、

57、实验技术1活性炭的处理除气活性炭是一种强吸附剂，对气体的吸附力及吸附量都很大。气体分子占据了活性炭的吸附表面，因而造成所谓活性炭“中毒” ，使其活力降低。同时，又有一些气体如氧气可引起某些副反应。最简单方便的方法就是加热烘千，可将吸附的绝大多数气体除去。一般在用前150加热干燥45小时即可。锦纶-活性炭，因锦纶受热温度高要变形，在用前100干燥45 小时即可。除金属离子医药用、化学纯、 766-1、 769活性炭在出厂前对所含杂质及重金属均经检查，符合规定要求。锦纶-活性炭在制备过程中也经大量酸洗、水洗，勿需特别处理即可应用。工业用活性炭在用前必须进行严格处理，一般处理方法有二：a. 加入 2

58、-3N 盐酸，水浴加热半小时，然后减压滤干，如此以酸处理二至三次，再以热蒸储水洗涤至pH56,滤干，烘箱中150c干燥8小时。置于瓶中，密塞备用。b.加20%醋酸水溶液，煮沸510分钟，减压滤干，以除去含氮杂质及部分金属离子。如此处理二至三次，再以热蒸储水洗至pH56,滤干。将其悬浮于水中，每100克活性炭中加入氰化钾 50 毫克(预防重金属离子的催化作用) ，直火加热，在60保持l0 分钟，趁热过滤，以热蒸储水洗至pH67,烘箱中100c干燥至恒重，于瓶中密塞备用。2减活性的方法活性炭对某些物质有不可逆的吸附作用，致使某些物质吸在上面无法洗脱。在此情况下必须对活性炭减活性；一般采用长链脂肪族

59、化合物，如硬脂酸、油酸、十一烷酸、十八烷、十八烷胺等。其中以硬脂酸为最常用。方法如下：活性炭以 1.5%(W/V) 硬脂酸乙醇液浸没，搅拌1 小时后，在搅拌下用 9 倍量的蒸馏水稀释，减压滤干，以蒸馏水洗，滤干后空气干燥或真空干燥，备用。3柱层析的操作装柱：活性炭在水中吸附力最强，一般在水中装柱。层析管内先加少量蒸馏水，再以玻璃纤维塞住底部。并除去玻璃纤维中的气泡。活性炭以蒸馏水浸泡l 小时左右，不断搅拌除去气泡。倒入柱中，让其自然沉降，装至所需体积，备用。粉末状活性炭因流速太慢，则需与硅藻土 （1:1）混合后，再用蒸储水调成糊状装柱。并且 待样品上柱后，层析管顶端连一有自动控制的加压泵或层析

60、管下端连一减压泵进行层析。（2）样品上柱样品一般用水溶解。浓度在2550%（g/mL）之间，即1克样品溶于24毫升水中。活性 炭层析的样品上柱量较大，一股每 100毫升活性炭可上样510克。在某些情况下，样品的 上柱量及样品浓度可适当增加或减少（参看聚酰胺层析实验技术项下“样品上样”）。某些样品在水中不易溶解时，可加适量甲醇、乙醇或丙酮使其溶解。但样品体积不可太 大，样品上柱量也应相应减少，否则影响分离效果。（3）洗脱：洗脱溶剂一般采用水、各种浓度的乙醇液。其它如 610%丙酮液、25%醋 酸、15%苯酚水溶液等（但不常用）。最常用的是水，由稀至浓的乙醇水溶液梯度洗脱。具 洗脱顺序是：水，10